用于检测小鼠卵母细胞及早期胚胎中转录因子的免疫荧光法研究

摘要

本实验旨在探索有效的染色前固定和渗透卵母细胞及早期胚胎的方法，以提高小鼠卵母细胞和早期胚胎免疫荧光染色的效果；同时检测RNA聚合酶II(PolII)在小鼠卵母细胞和早期胚胎的表达，探讨PolII在卵母细胞和早期胚胎发育中的作用。为大规模地精确检测小鼠卵母细胞和胚胎中的蛋白质与转录因子打下坚实基础。 以小鼠卵母细胞和早期胚胎为试验材料，采用4种不同的固定及渗透方法处理。方案A：先用4％多聚甲醛(PFA)固定1h，再用0.5％TritonX-100穿透10min；方案B：先用0.5％TritonX-100穿透10min，再用4％PFA固定1h；方案C：用1％PFA+0.2％TritonX-100同时固定与穿透1h；方案D：用-20℃预冷甲醇固定15min，再用0.5％TritonX-100孵育10rain。分析10种转录因子(TFIIA、TFIIB、TAF1、TAF4、PolII、BRF1、MeCP2、MBD2ab、HP1α及HP1β)在小鼠卵母细胞中的免疫荧光染色效果。结果表明，C方案能够完全检测并标记出10种转录因子的荧光信号，其它3种方案都只能检测出部分转录因子的荧光信号；对荧光信号精细分布模式与动态变化最典型的TFIIB进行仔细分析，表明经C方案处理后10种转录因子抗体标记信号的分布模式很精细，荧光信号的分布清晰，能观察到信号随细胞核成熟而发生的动态变化，卵母细胞的形态完好；其它3种方案处理后卵母细胞中虽然能够观察到核仁，也能观察到信号基本均匀地分布于核区，但不能清楚地显示荧光信号在核仁内是否有分布及信号的动态变化过程，荧光染色效果不理想。 在光镜下观察4种方案处理后的卵母细胞，着重比较GV期、MI期、MII期的卵母细胞和2-细胞期胚胎形态，C方案处理后的卵母细胞形态保存较好，GV期细胞核和核仁结构清晰，细胞质均匀分布，形态饱满；MI期透明带紧实清晰，厚薄均匀，胞质的颗粒状突起明显；MII期第一极体结构和2.细胞期的极体结构都保存完好。其它3种方案处理后卵母细胞的形态变形，各发育时期的核仁、透明带、极体等结构受到不同程度的破坏。尤其以D方案对细胞形态的破坏最大，说明-20℃预冷甲醇不适用于小鼠卵母细胞和早期胚胎的固定。 对PolII在小鼠卵母细胞和早期胚胎中的表达进行分析：GVBD后直到MII的卵母细胞中和Ana、PN1阶段的胚胎中都没有检测到PolII的信号，而在受精后的PN2、PN3的部分胚胎中检测到信号，PN4、PN5和2-细胞阶段的胚胎全部是阳性。这种表达情况和早期的基因沉默相吻合，支持了关于转录沉默的假说。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

1 前言

1.1免疫荧光法的研究历史

1.2免疫荧光法中固定的原理

1.2.1固定的目的和机制

1.2.2几种固定液的特点

1.3激光扫描共聚焦显微镜

1.4卵母细胞的特殊性

1.5卵母细胞和早期胚胎的发育分期

1.5.1卵母细胞发育成熟

1.5.2 GV期卵母细胞染色质结构变化与分期

1.5.3小鼠1-细胞胚胎的原核形态分期

1.6十种转录因子的背景信息

1.7本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1试验材料

2.1.1试验动物

2.1.2试验药品及器材

2.1.3溶液的配制与吸卵针的制作

2.2试验方法

2.2.1 GV期卵母细胞的收集

2.2.2 MⅡ期卵母细胞的收集

2.2.3受精卵的收集

2.2.4卵母细胞和受精卵的培养

2.2.5免疫荧光法步骤

2.3试验设计

3 结果与分析

3.1四种方案处理后的十种转录因子免疫荧光染色结果统计

3.2四种方案处理后十种转录因子在卵母细胞内的精细分布模式

3.3四种方案处理后光镜下的卵母细胞和2-细胞期胚胎形态

3.4 C方案处理后的PolⅡ荧光信号分布动态变化图

3.4.1 PolⅡ在减数分裂卵母细胞中的亚细胞分布

3.4.2 PolⅡ在早期胚胎中的亚细胞分布

4 讨论

4.1固定液成分与固定程序

4.2四种方案处理结果不同的原因分析

4.3试验操作中的改进点

4.3.1透明带的去留

4.3.2与激光扫描共聚焦显微术结合

4.3.3操作步骤的简化改进与试验体会

4.4 PolⅡ与小鼠卵母细胞和胚胎的转录沉默

5结论

参考文献

致谢

附录