大肠杆菌质粒介导的耐氟喹诺酮类药物6个基因PCR检测研究

摘要

本研究选择2006-2008年从四川、河南、甘肃、福建和江西5个省区的规模化猪场、医院及野生动物园分离鉴定的共256株大肠杆菌作为实验菌株。采用K-B纸片法检测大肠杆菌6种常见FQs（氟喹诺酮类药物）：NA（奈啶酸）、CIP（环丙沙星）、OFX（氧氟沙星）、ENR（恩诺沙星）、NOR（诺氟沙星）及LEV（左旋氧氟沙星）的耐药表型。研究结果表明，256株实验菌株对6种氟喹诺酮类药物的总耐药率分别为：萘啶酸(50.00％)、诺氟沙星(48.83％)、氧氟沙星(48.05％)、恩诺沙星(47.66％)、环丙沙星(44.14％)和左旋氧氟沙星(40.63％)。其中，猪源菌株耐药率为54.69％，以对诺氟沙星耐药为主(52.14％)；人源菌株耐药率为60.86％，以对萘啶酸耐药为主(64.13％)；野生动物源菌株虽然对6种氟喹诺酮类药物相对敏感，但仍然检测出低水平的耐药性，耐药率为12.50％，以对诺氟沙星耐药为主(8.33％)。
　　 本研究选择PMQR（质粒介导氟喹诺酮类耐药）基因qnrB、qnrS和qnrD为本次三重PCR检测方法建立的目的基因，并在确定单基因PCR扩增体系各个参数的最佳值和可变动范围的基础上进行目的基因三重PCR扩增体系的建立与优化，其中包括模板制备、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度等、退火温度、循环次数等相关参数的优化，得出三重PCR最佳反应体系：10×PCRBuffer2.5μl,MgCl2(25mmol/L)3μ1,dNTP(2.5mmol/L)3.5μl，模板2.5μ1(菌液浓度相当于McFarlandNo1.0),TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)0.35μ1，上下游引物(25mmol/L)各添加：qnrB(0.9μl)、qnrS(0.6μl)、qnrD(0.5μl)，最后补充灭菌去离子至25μl。最佳扩增反应参数为：94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。4℃保存。运用建立的大肠杆菌PMQR基因三重PCR方法检测256株猪源、人源及野生动物源大肠杆菌中的PMQR基因(qnrB、qnrS和qnrD),同时采用单一PCR方法检测qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA基因。结果表明：检出率田高到低依次为aac(6′)-Ib-cr(59.38％)、qnrD(30.47％)、qnrA(30.47％)、qepA(25.00％)、qnrS(20.70％)、qnrB(19.53％)。猪源菌株中aac(6二)-Ib-cr和qnrD检出率高，分别为69.29％和43.57％。aac(6′)-Ib-cr和qnrS在人源菌株中分布较普遍，检出率分别为54.35％和37.00％。qnrB、qepA和aac(6′)-Ib-cr均在野生动物源菌株中有一定检出率，其中，aac(6′)-Ib-cr基因分布较普遍，检出率为20.83％。qnrA、qnrS和qnrD基因未在野生动物源菌株中检测到。
　　 本研究对6种PMQR基因qnrB、qnrS、qnrD、qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA在国内猪源、人源及野生动物源大肠杆菌中的检测情况作了系统全面的分析。为该领域的研究工作提供了有价值的基础数据。

目录

文摘

英文文摘

1 前言

1.1 氟喹诺酮类药物的应用及耐药进展

1.1.1 氟喹诺酮类药物应用现状

1.1.2 氟喹诺酮类药物耐药进展

1.2 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药性检测方法研究进展

1.3 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药机理

1.3.1 染色体介导的大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药机理

1.3.2 质粒介导的大肠杆菌对氟喹诺酮类药物耐药机理及本研究目的基因

1.5 本研究的目的意义

1.6 本研究的创新点

1.7 本研究的技术路线

2 实验材料

2.1 实验菌株及质粒

2.2 主要实验试剂

2.3 主要仪器

3 实验方法

3.1 细菌纯化鉴定

3.1.1 形态学鉴定

3.1.2 生化鉴定

3.1.3 致病性鉴定

3.2 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物药敏试验

3.3 大肠杆菌3个PMQR基因（qnrB、qnrS、qnrD）三重PCR检测方法的建立

3.3.1 三重待扩增目的基因的选择及PCR引物设计

3.3.2 三重PCR模板制备方法的选择和优化

3.3.3 单基因qnrB、qnrS和qnrD基因PCR扩增体系及可变范围确立

3.3.4 qnrB、qnrS、qnrD基因阳性菌株鉴定

3.3.5 三重PCR反应体系的优化及建立

3.3.6 三重PCR检测方法特异性试验

3.3.7 三重PCR检测方法灵敏度试验

3.4 大肠杆菌PMQR基因qnrA、aac(6′)-Ib-cr、qepA单一PCR检测

3.4.1 qnrA、aac(6)-Ib-cr和qepA引物设计

3.4.2 PCR模板制备

3.4.3 单基因qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepAPCR扩增体系

3.4.4 qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA基因阳性菌株鉴定

3.5 质粒介导的6种耐氟喹诺酮类药物基因qnrB、qnrS、qnrD、qnrA、aac(6)-Ib-cr和qepA在大肠杆菌中的检测

3.3.1 用三重PCR方法检测PMQR基因qnrB、qnrS和qnrD

3.5.2 单一PCR方法检测PMQR基因qnrA、aac(6)-Ib-cr和qepA

3.5.3 六种PMQR基因检测结果与耐药表型检测结果比较

4 结果与分析

4.1 细菌纯化鉴定结果

4.1.1 纯化培养及形态学鉴定结果

4.1.2 生化鉴定结果

4.1.3 致病性鉴定结果

4.2 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物药敏试验结果

4.2.1 不同来源大肠杆菌耐药率检测结果

4.2.2 不同地区大肠杆菌耐药率检测结果

4.3 大肠杆菌3个PMQR基因(qnrB、qnrS、qnrD)三重PCR检测方法的建立

4.3.1 单基因PCR最佳扩增参数及可变范围

4.3.2 qnrB、qnrS、qnrD基因阳性对照测序结果及分析

4.3.3 三重PCR反应体系的优化及建立

4.3.4 三重PCR检测方法特异性试验结果

4.3.5 三重PCR检测方法灵敏度试验结果

4.4 大肠杆菌PMQR基因qnrA、aac(6)-Ib-cr和qepA单一PCR检测

4.4.1 单基因qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA的PCR扩增结果

4.4.2 耐药基因qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA阳性对照测序结果及分析

4.5 质粒介导的6种耐氟喹诺酮类药物基因qnrB、qnrS、qnrD、qnrA、aac(6′)-Ib-cr和qepA在大肠杆菌中的检测结果

4.6 六神PMQR基因在大肠杆菌中的检测结果与耐药表型比较

5 讨论

5.1 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药表型特点

5.2 大肠杆菌PMQR三基因(qnrB、qnrS和qnrD)三重PCR检测方法建立

5.2.1 三重PCR扩增目的耐药基因的选择

5.2.2 关于三重PCR反应引物设计原则

5.2.3 关于三重PCR反应模板制各方法的筛选与优化

5.2.4 关于三重PCR反应方法建立和优化的影响因素

5.2.5 三重PCR方法在检测PMQR基函上的优点与不足

5.3 六种PMQR基因在256株大肠杆菌中的检测

5.4 大肠杆菌对氟喹诺酮类药物的耐药率与6种PMQR基因检测结果比较

5.5 进一步研究的建议

6．结论

参考文献

致谢

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