苦荞WD40转录因子的基因克隆及其对花青素合成的影响

摘要

苦荞(Fagopyrum tataricum)为蓼科荞麦属双子叶禾谷类作物。苦荞作为一种药食两用作物，其最重要的生物活性成分为黄酮，以芦丁为代表的黄酮醇是其主要储存形式。然而，在遭受冷和紫外等胁迫时，另外一类黄酮花青素的合成则对苦荞逆境生理的稳定具有重要作用。植物花青素的生物合成在转录水平主要受到R2R3-MYB、bHLH和WD40等转录因子蛋白单独或者形成三元复合物的调控，其中转录因子WD40更多的是提供平台促进转录因子MYB和bHLH的互作。本研究以“西荞2号”苦荞为材料，克隆花青素调控相关转录因子FtWD40的cDNA序列，并鉴定其转录激活活性;分析花青素和FtWD40基因表达在苦荞中的组织特异性及其相关性，也分析了在苦荞逆境胁迫条件下二者变化趋势间的相关性;进一步通过转基因技术鉴定FtWD40过表达对烟草花青素合成的影响。本研究可望明确苦荞转录因子FtWD40对在花青素合成途径中的主要效应基因，加深对苦荞逆境胁迫中花青素合成调控分子机制的认识。主要取得以下研究结果:
　　1、采用同源克隆法和RACE技术，获得1条苦荞WD40基因，命名为FtWD40。FtWD40 ORF框为1035 bp，编码344个氨基酸残基，相对分子质量65.9 KDa;聚类分析结果显示，FtWD40和参与花青素代谢调控的AtTTG1和VvWD等聚为一簇。对花期苦荞根、茎、叶和花中的花青素含量，以及FtWD40基因表达的测定表明，花青素含量和FtWD40的基因表达量都具有相同的组织特异，均为花＞根＞叶＞茎，二者相关性系数为r=0.875(P＜0.05)。在冷胁迫和UV-B胁迫下，芽期苦荞花青素含量与FtWD40基因表达量的相关系数分别为r=0.785(P＜0.05)和r=0.891(P＜0.05)。以上结果表明，FtWD40可能参与了苦荞花青素合成的调控。
　　2、构建pBridge-FtWD40真核表达载体，转化酵母AH109，经SD/-Trp/-His双缺培养筛选获得阳性转化子。经酵母单杂交系统中的β-半乳糖苷酶活性滤纸分析，结果表明FtWD40蛋白具有转录激活活性。
　　3、构建pECMBIA1301-Ft WD40植物表达载体，采用农杆菌侵染法转化烟草愈伤组织，进而对筛选获得的阳性转基因烟草中花青素含量及花青素合成途径中的NtPAL、NtCHS、NtANS、NtDFR、NtFLS和NtF3'H等基因的表达量进行了测定分析。FtWD40转基因烟草T-1、T-2和T-3株系中的花青素含量分别提高为对照平均的3.45倍、2.81倍和3.24倍(P＜0.01)。同时，qRT-PCR结果显示:NtPAL、NtCHS和NtF3'H的表达量没有显著变化（P＞0.05），NtDFR和NtANS的表达量分别提高为对照组的1.95倍和1.56倍(P＜0.01)，而FLS的表达量则降低为对照的0.79倍（P＜0.05）。以上结果表明，FtWD40具有增强转基因烟草花青素合成的作用。

目录

声明

摘要

符号说明

1 前言

1．1 植物花青素的研究进展

1．1．1 花青素的结构和基本功能

1．1．2 花青素的生物合成途径

1．1．3 花青素生物合成代谢途径的分子调控

1．1．4 影响花青素生物合成代谢途径的环境因素

1．2 植物WD40转录因子的研究进展

1．2．1 WD40转录因子的结构特征

1．2．2 WD40转录因子功能的多样性

1．3 苦荞黄酮及其代谢

1．4 研究的目的和意义

2 材料方法

2．1 材料

2．1．1 植物材料和菌种

2．1．2 主要试剂和药品

2．1．3 溶液和培养基

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 苦荞总RNA的提取与cDNA第一链的制备

2．2．2 5'-RACE和3'-RACE cDNA模板的制备

2．2．3 苦荞WD40基因的克隆

2．2．4 苦荞花青素含量的组织特异性与WD40基因表达的相关性分析

2．2．5 逆境胁迫下苦荞花青素含量与FtWD40基因表达量分析

2．2．6 酵母单杂重组质粒构建及酶切鉴定

2．2．7 苦荞pBridge-FtWD40重组质粒转化酵母细胞

2．2．8 FtWD40转录激活活性的的滤纸分析

2．2．9 FtWD40植物表达载体的构建及酶切鉴定

2．2．10 FtWD40植物表达载体转化农杆菌

2．2．11 农杆菌介导的烟草的遗传转化

2．2．12 转基因烟草的阳性筛选

2．2．13 转基因烟草中花青素含量的测定

2．2．14 转基因烟草中花青素合成关键酶基因的表达分析

3 结果与分析

3．1 FtWD40的基因克隆及序列分析

3．1．1 苦荞总RNA的提取

3．1．2 苦荞FtWD40基因保守域的克隆

3．1．3 苦荞FtWD40基因5'-cDNA和3'-cDNA末端的克隆

3．1．4 苦荞FtWD40基因cDNA的扩增

3．1．5 苦荞FtWD40基因的生物信息学分析

3．2 苦荞花青素积累与FtWD40的基因表达的相关性分析

3．2．1 苦荞组织花青素含量测定

3．2．2 FtWD40在苦荞中的表达量分析

3．2．3 相关性分析

3．2．4 逆境胁迫下花青素含量测定

3．2．5 逆境胁迫下FtWD40在苦荞中的表达量分析

3．2．6 相关性分析

3．3 苦荞转录因子FtWD40的转录激活鉴定

3．3．1 pBridge-FtWD40表达载体的构建

3．3．2 苦荞FtWD40的转录激活鉴定

3．4 苦荞FtWD40超表达对转烟草花青素合成的影响

3．4．1 pCMBIA-1301-FtWD40植物表达载体的构建

3．4．2 FtWD40转基因烟草的筛选和鉴定

3．4．3 FtWD40转基因烟草中花青素含量测定

3．4．4 转基因烟草中花青素合成途径中酶基因的表达分析

4 讨论

4．1 WD40-repeat蛋白的进化分析

4．2 WD40-repeat蛋白结构与功能的分析

4．3 WD40-repeat蛋白的调控机理

参考文献

致谢

硕士期间发表或待发表的文章