一个水稻光合作用相关基因C6635的克隆与功能分析

摘要

光合作用是地球上最重要的化学反应之一，可分为光反应和暗反应（碳固定）。卡尔文循环是高等植物唯一用于CO2固定的生化途径，在C3植物中，它是由叶绿体内的11种酶催化的13个酶促反应完成。由于卡尔文循环在植物代谢和作物产量中起着不可替代的作用，因此，研究卡尔文循环通路中的相关基因，对作物育种具有很重要的作用。本试验利用化学诱变剂EMS处理水稻粳稻品种中花11，获得了一个稳定遗传的少分蘖突变体c6635，在前期基因定位的基础上对该突变体进行基因克隆及功能分析，主要结果如下。
　　(1)表型观察及农艺性状分析:突变体c6635在苗期表现为淡绿叶，随后慢慢转绿，孕穗期叶片恢复正常绿色。突变体生长较野生型缓慢，抽穗期推迟15天左右;株高、分蘖数、主茎着粒数和结实率极显著降低，分别降低了27.4％、67.5％、41.8％和35.7％;主穗长和千粒重也均有所下降，但并无显著差异。说明c6635突变基因对水稻主要农艺性状产生了较大影响，尤其是分蘖数。
　　(2)色素含量测定:与野生型相比，c6635苗期总叶绿素含量、Chl a、Chl b、类胡萝卜素分别降低36.5％、35.5％、43.2％、17.1％;随着植株生长到抽穗期，c6635突变体叶片颜色逐渐加深，光合色素也较苗期增加，但相比于野生型色素含量仍相对减少。表明c6635突变体苗期叶片呈淡绿色，是由光合色素含量降低造成的。
　　(3)叶绿体超微结构观察:与野生型叶绿体相比，c6635突变体叶绿体内基粒片层垛叠较野生型少。表明C6635基因突变影响叶绿体发育。
　　(4)候选基因遴选:实验室前期将突变基因定位在水稻第4染色体上，物理距离为5198kb的区间内。随后，采用高通量测序结合MutMap方法进行基因定位及遴选候选基因，结果发现了一个候选基因DNA序列2143位（对应cDNA序列1091位）碱基由G突变为A，造成编码氨基酸第364位由甘氨酸(G)突变为天冬氨酸(D)，该基因位于H4和H5定位区间，编码的蛋白质参与了卡尔文循环，同时再测序证实了该突变位点。推测该突变可能与少分蘖突变体有关，暂且命名为c6635。
　　(5)转基因功能互补验证:构建转基因表达载体pC2300-Actin-C6635，通过农杆菌介导法将野生型基因C6635转入突变体中，获得的阳性转基因植株分蘖数均恢复野生型水平，说明该少分蘖突变体的性状是由C6635基因突变引起的。
　　(6)光合相关参数测定:突变体c6635与野生型中花11相比，突变体c6635净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)分别降低46％，19.23％和13.67％，而胞间CO2浓度(Ci)增高14.35％。转基因植株光合参数基本恢复野生型水平，这表明c6635对植株光合作用产生了较大的影响。
　　(7)淀粉碘化钾染色:用2％的碘化钾溶液对苗期植株进行染色，结果发现野生型中花11染色较突变体c6635更深。表明c6635突变体中淀粉合成受到抑制。
　　(8)亚细胞定位:构建pC2300-35S-eGFP表达载体，转入水稻原生质体中瞬时表达，激光共聚焦显微镜观察显示C6635基因编码的蛋白质定位在叶绿体上。
　　(9)组织表达分析:RT-PCR分析显示，C6635基因在苗期和孕穗期叶片中的表达量均较高，在孕穗期茎、叶鞘和穗中只有微量的表达，而在苗期和孕穗期根中均没有表达，说明C6635基因只在植物绿色组织中表达。
　　(10)实时荧光定量PCR分析:对卡尔文循环途径中6个基因表达分析显示，rbcL和SBPASE这两个基因的表达量在突变体中高于野生型，rbcS、FBP、FBA、PPK表达量均低于野生型，这可能是由于他们在卡尔文循环中不同的作用引起的，rbcL和SBPASE都属于限速酶基因，虽然rbcS是Rubisco的小亚基基因，但起催化作用的主要是大亚基rbcL，而其他几个基因表达量下降，可能是由于位于C6635基因下游，或邻近上游，所以C6635直接或间接抑制了他们的表达。

目录

声明

摘要

缩写词

1文献综述

1．1光合作用

1．1．1光反应

1．1．2暗反应(碳固定反应)

1．2卡尔文循环相关基因的表达调控

1．2．1卡尔文循环限速酶的表达调控

1．2．2卡尔文循环其他关键酶的表达调控

1．3影响卡尔文循环相关基因表达调控的因素

1．4卡尔文循环对生物产量的影响

1．5本研究的目的与意义

2材料与方法

2．1供试材料与仪器设备

2．1．1供试材料

2．1．2仪器设备

2．2实验方法

2．2．1 c6635主要农艺性状调查

2．2．2 c6635色素含量测定

2．2．3 c6635超微结构观察

2．2．4候选基因生物信息学分析与克隆

2．2．5 c6635转基因功能互补验证实验

2．2．6光合相关参数测定

2．2．7淀粉碘化钾染色

2．2．8亚细胞定位

2．2．9组织表达模式分析(RT-PCR)

2．2．10实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

3结果分析

3．1 c6635表型和农艺性状分析

3．2 c6635不同时期叶绿素含量测定

3．3 c6635透射电镜分析

3．4 c6635突变基因的MutMap克隆及候选基因鉴定与生物信息学分析

3．5光合作用相关参数分析

3．6淀粉碘化钾染色

3．7 c6635转基因功能互补验证实验

3．7．1基因克隆与转基因表达载体构建

3．7．2质粒转化和转基因植株检测

3．8 C6635蛋白的亚细胞定位

3．9 C6635基因组织表达模式分析

3．10 qRT-PCR分析

4讨论

参考文献

致谢

作者简历