大豆光合作用相关基因GmDeg的克隆及其功能分析

摘要

强光会抑制光合功能，破坏光合作用器官，从而降低PSⅡ光化学效率和光合效率，这个过程被称为光抑制。PSⅡ反应中心对光抑制非常敏感，其中D1蛋白是光破坏的主要目标。损伤的D1蛋白由蛋白酶降解，并由新合成的D1蛋白组装到复合体中，重新被激活行使正常功能。在这个过程中，蛋白酶起到了关键作用。本研究开展大豆光合作用相关基因GmDeg的克隆及其功能分析，获得主要结果如下:
　　 1.以AtDeg1序列为探针在大豆基因组数据库中搜索并在大豆cDNA中克隆出GmDeg1和GmDeg2，分别位于第19条和第5条染色体上，读码框长度分别为1296bp和1281bp，分别与AtDeg1同源性达71.69％和70.78％。生物信息学分析结果表明GmDeg1和GmDeg2属于丝氨酸蛋白酶家族，含有PDZ结构域，并且推测GmDeg1和GmDeg2与AtDeg1有着相似的功能，即对损坏的D1蛋白具有降解作用，从而加速D1的周转。
　　 2.用MV（甲基紫精）对大豆植株模拟光氧化处理，荧光定量分析结果表明在12h时，GmDeg1和GmDeg2表达量明显增加，表明GmDeg1和GmDeg2可能在光保护机制中起作用。
　　 3.在大肠杆菌中表达出GmDeg1和GmDeg2重组蛋白，利用NI-NTA层析柱纯化蛋白。酶活试验结果显示在温度为20℃-60℃，pH为5.0-8.0时，GmDeg1和GmDeg2具有活性。而在丝氨酸蛋白酶抑制剂的存在下，蛋白酶对底物无降解作用。结果证明了GmDeg1和GmDeg2属于丝氨酸蛋白酶家族，在体外具有降解模式底物的能力，为活体内可能降解类似D1蛋白的损伤或错误折叠的蛋白提供了证据。
　　 4.通过转化拟南芥获得转基因植株。取离体叶片在强光下作处理，叶绿素荧光仪测量叶片Fv/Fm，野生型作对照。结果显示，在某些时间点上，转GmDeg1和GmDeg2基因植株的Fv/Fm值明显比野生型高，在林可霉素存在下，情况依然如此。推测GmDeg1和GmDeg2对损坏的D1蛋白具有降解作用，从而加速了PSⅡ光化学效率的恢复。

目录

声明

摘要

缩略语表及其英汉对照

第一章 文献综述

1 植物光合作用光抑制分子机理

1．1 活性氧的产生

1．2 PSⅡ反应中心光破坏分子机理

1．3 PSⅠ光抑制特点及其分子机理

2 植物的光保护机制

2．1 热耗散

2．2 LHCⅡ磷酸化与光能分配

2．3 Mehler反应和活性氧清除系统

2．4 光呼吸

2．5 PSⅡ反应中心活性的降低

2．6 硝酸还原代谢

2．7 D1蛋白的周转

3 D1蛋白的研究进展

3．1 D1蛋白的结构和功能

3．2 D1蛋白的周转

3．3 与D1蛋白降解相关的蛋白酶

3．4 Deg蛋白酶的研究进展

4 本研究的目的和意义

第二章 GmDeg1和GmDeg2基因克隆以及表达分析

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 质粒、菌株及主要试剂

1．3 植物总RNA的提取

1．4 cDNA第一链的合成

1．5 GmDeg1和GmDeg2基因克隆

1．6 序列和系统进化树分析

1．7 荧光定量分析

2 结果与分析

2．1 基因克隆

2．2 序列分析和比对

2．3 系统进化树分析

2．4 光氧化胁迫下GmDeg1和GmDeg2的表达分析

3 讨论

第三章 GmDeg1和GmDeg2体外表达和活性试验

1 材料和方法

1．1 质粒、菌株及主要试剂

1．2 载体构建

1．3 诱导表达蛋白

1．4 亲和纯化蛋白

1．5 Western Blot验证目的蛋白

1．6 蛋白浓缩和蛋白定量

1．7 蛋白酶活试验

2 结果与分析

2．1 原核表达载体构建

2．2 诱导表达蛋白及纯化蛋白

2．3 蛋白酶活试验

3 讨论

第四章 GmDeg1和GmDeg2基因功能验证

1 材料和方法

1．1 植物材料

1．2 质粒，菌株及主要试剂

1．3 载体构建

1．4 农杆菌感受态的制备以及转化农杆菌

1．5 floral dip法转化拟南芥

1．6 转基因苗的筛选及检测

1．7 PSⅡ光化学效率(Fv/Fm)的测定

2 结果与分析

2．1 过表达载体的构建及转化农杆菌

2．2 转基因苗的筛选和PCR检测

2．3 PSⅡ叶绿素荧光参数(Fv/Fm)的测定

3 讨论

全文结论

参考文献

附录

致谢