RpoS因子对鼠伤寒沙门菌在环境胁迫下生长情况的调控研究

摘要

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）是食源性致病菌，也是引起急性胃肠炎的主要病原菌之一。沙门氏菌分布广泛，对外界环境的抵抗力较强，沙门氏菌的污染给食品行业带来很大的经济损失。沙门氏菌在应对外界环境时，能够通过自身的调控机制不断适应恶劣环境，其中RpoS因子在其中起着很重要的作用。为了深入研究RpoS因子对稳定期鼠伤寒沙门氏菌在环境胁迫下的调控机制，本研究首先将鼠伤寒沙门氏菌亲本菌株SL1344和鼠伤寒沙门氏菌rpoS基因缺失菌株SL1344/△rpoS在不同的环境胁迫下培养，初步判断RpoS在环境胁迫下起到的作用，然后选择渗透压胁迫下的稳定期菌株进行转录组测序分析，进一步研究RpoS在渗透胁迫下的调控机制。结果如下:
　　1)将SL1344和SL1344/△rpoS在单一环境胁迫下(3.5％NaCl，pH4.0，42℃)培养，在3.5％NaCl中受到的抑制作用最强，pH4.0次之，42℃最弱;
　　2)将SL1344和SL1344/△rpoS分别在不同盐浓度中刺激不同时间后置于3.5％NaCl中培养，SL1344在不同盐浓度中刺激相同时间后均能生长，且在对数期相同时间点的菌浓大小均遵循5％＜3.5％＜0％的规律，表明SL1344的生长能力随着盐浓度增加而减弱;而SL1344/△rpoS在不同盐浓度中刺激相同时间后，在对数期相同时间点的细菌浓度分布规律与SL1344不同，在5％NaCl中刺激后，再在3.5％NaCl生长时的延滞期较长，甚至不生长，而在0％NaCl和3.5％NaCl中分别刺激不同时间后的的生长则趋于一致，均为60min＜30min＜3h。结果表明，RpoS在鼠伤寒沙门氏菌应对渗透压胁迫时起到很重要的调控作用。
　　3)为了研究RpoS对鼠伤寒沙门氏菌在渗透压胁迫下的调控机制，以及pH4.0前处理对鼠伤寒沙门氏菌在渗透压胁迫下的生存影响，将SL1344和SL1344/△rpoS分别经pH4.0前处理或不经前处理之后置于3.5％NaCl中，比较两种情况下SL1344和SL1344/△rpoS的生长情况，并提取稳定期的RNA，用转录组测序技术研究渗透压条件下差异基因表达情况。转录组测序结果显示，在渗透压胁迫下，鼠伤寒沙门氏菌中一些与渗透压相关的基因受RpoS调控，且受RpoS负调控的差异基因多于受RpoS正调控的差异基因，这些基因按功能分类有碳水化合物代谢（katE、otsA、otsB、glgC、glgX、sgrT、celA等），氨基酸代谢（asnA、metA、metH、aroQ等），跨膜运输（sfbA、sfbB、yehZ、ugpB、artJ、chaA等），转录调控(yeaG、marB、marA、marR、yaiB、hilC、hilD等），能量代谢（arsA、arsB、arsC、osmC等）等，这些不同功能基因的差异表达能增强鼠伤寒沙门氏菌对渗透压的抗逆性。SL1344和SL1344/△rpoS经pH4.0前处理后的生长情况与未经前处理相比，SL1344在两种情况下的生长情况比较相似，但SL1344/△rpoS的生长情况相差较大，未经处理的SL1344/△rpoS的延滞期比经pH4.0前处理的延滞期长，到达稳定期需要的时间也较长，但经pH4.0处理的稳定期SL1344和SL1344/△rpoS与不经前处理的稳定期SL1344和SL1344/△rpoS的转录组结果相比，相同菌株在不同试验条件下的差异基因相差较小，可能是因为pH4.0的前处理只对延滞期的相关基因的表达影响较大，而在稳定期，这些差异已消失。
　　4)选择渗透压条件下受RpoS调控且参与主要代谢与调控过程中的差异基因进行qPCR验证，其结果与转录组测序结果中差异基因的表达趋势一致，但差异倍数不一致，表明转录组测序结果有效。
　　对鼠伤寒沙门氏菌在环境胁迫下的生长情况以及渗透压环境下的转录组测序研究，为深入研究沙门氏菌在环境胁迫下的调控机制，以及为鼠伤寒沙门氏菌疾病的预防和控制奠定基础。

目录

声明

摘要

1前言

1．1沙门氏菌

1．2沙门氏菌应对环境胁迫方面的研究现状

1．3 RpoS因子的研究现状

1．4转录组测序技术的研究现状

1．5课题研究的主要内容和意义

1．5．1研究内容

1．5．2课题研究的意义

2材料与方法

2．1试验菌株

2．2主要试剂

2．3主要试验仪器

2．4试验方法

2．4．4 RNA的提取

2．4．5转录组文库构建及测序

2．4．6数据分析

2．4．7 qPCR验证差异表达基因

3结果与分析

3．1 SL1344和SL1344／ΔrpoS在单一环境胁迫下的生长情况

3．2 SL1344和SL1344／ΔrpoS在不同盐浓度处理不同时间后置于3．5％NaCl中的生长情况

3．3 SL1344和SL1344／ΔrpoS经pH 4．0的前处理和不经前处理直接置于3．5％NaCl中的生长情况

3．4 RNA的提取与检测

3．5转录组测序结果与分析

3．5．1测序数据质量评估

3．5．2参考序列比对分析

3．5．3基因表达水平分析

3．5．4差异基因表达情况

3．5．5差异基因GO富集分析

3．5．6差异表达基因分析

3．6差异基因的qPCR验证

4讨论

5结论与展望

5．1结论

5．2展望

参考文献

附图

致谢

作者简历