枯草芽孢杆菌6-磷酸葡萄糖脱氢酶的分离纯化和部分性质

摘要

枯草芽孢杆菌通过超声破壁、(NH<,4>)<,2>SO<,4>分段盐析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Blue Sepharose CL-6B亲和层析、Sephadex G-200凝胶过滤等纯化步骤,分离出6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD).经PAGE和SDS-PAGE检测为单一蛋白区带,比活力为1.7375IU/mg,纯化倍数为72.7,收率为13.6﹪.凝胶过滤法测定该酶表观分子量约为220kD,SDS-PAGE测定亚基分子量约为50.5kD,可见该酶是由四个相同亚基构成的四聚体.等电聚焦电泳测得等电点为6.3,用动力学方法测得该酶的最适反应pH为8.5,最适反应温度为37℃,以6-磷酸葡萄糖(G6P)为底物的Km值为0.177mmol/L.用常见的荧光淬灭剂丙烯酰胺和KI研究G6PD分子中Trp残基的微环境,发现它们对分子中Trp残基的荧光均有淬灭作用,丙烯酰胺能淬灭100﹪的荧光,KI能淬灭78﹪的荧光,表明分子中小部分Trp残基埋藏在分子内部,大部分Trp残基处于分子表面的极性环境中.

目录

摘要

Abstract

前言

第一部分菌体的培养和G6PD的分离纯化

1.材料、试剂和仪器

2.方法

2.1菌株的培养

2.2 G6PD的分离纯化

2.3 G6PD活性测定

2.4蛋白质浓度测定

2.5 G6PD纯度鉴定

2.6 G6PD活性染色

3.结果

4.讨论

第二部分G6PD结构和部分性质研究

1.材料、试剂和仪器

2.方法

2.1分子量测定

2.2等电点的测定

2.3pH值对酶活力的影响

2.4温度对酶活力的影响

2.5米氏常数Km的测定

2.6部分金属离子对紫外吸收光谱的影响

2.7圆二色谱的测定

2.8部分金属离子及EDTA对酶活力和荧光光谱的影响

2.9荧光淬灭

3.结果

3.1分子量的测定

3.2等电点的测定

3.3 pH值对酶活力的影响

3.4温度对酶活力的影响

3.5米氏常数Km的测定

3.6部分金属离子对G6PD紫外吸收光谱的影响

3.7圆二色性

3.8部分金属离子和EDTA对酶活力和荧光光谱的影响

3.9荧光淬灭

4.讨论

参考文献

综述6-磷酸葡萄糖脱氢酶研究进展

1.前言

2.G6PD的结构与功能

2.1氨基酸组成和顺序

2.2亚基组成

2.3空间构象和活性中心

2.4同工酶

2.5功能

2.6 HMP与甘露醇、ED途径之间的关系

3.分类

4.酶催化反应机理和动力学

5.G6PD基因

5.1基因结构

5.2G6PD基因的克隆与表达

6.G6PD基因多态性与疾病

7.应用前景与展望

参考文献

致谢

声明书