性逆转石斑鱼性腺差异表达基因的克隆鉴定及其表达研究

摘要

赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)是名贵海水经济鱼类,雌雄同体,雌性先熟,存在天然性逆转现象.雌鱼一般在6龄性逆转为雄鱼,因而雌雄亲鱼性成熟不同步,导致受精率较低,制约着石斑鱼的人工大规模养殖.目前主要是用雄性激素来培育雄亲鱼,但激素的过多应用有很多弊端,要想彻底摆脱激素诱导性转,只有阐明其性别逆转的分子机制,才能进行人工改良以达到性别控制.用甲睾酮片饲喂2~4龄赤点石斑鱼,6周后90％以上的雌鱼性逆转为功能性雄鱼.应用SMART技术构建了石斑鱼性反转前、后性腺组织的SMART cDNA文库.用抑制性差减杂交(SSH)技术构建了性反转雄鱼性腺差异表达基因的差减cDNA文库(正向差减文库)和正常雌鱼性腺差异表达基因的差减cDNA文库(反向差减文库).从差减cDNA库中随机挑取1200个克隆进行了PCR筛选和斑点杂交筛选,得到120个差异表达cDNA片段.挑选71个cDNA克隆测序,将所测序列经GenBank检索,发现有51个cDNA片段序列无明显的同源性,20个片段与报道的基因有较高同源性.运用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),结合SMART cDNA合成和RACE-PCR方法,从性反转雄鱼性腺的差减cDNA文库中克隆到了石斑鱼一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因(EPIN).该基因cDNA全长为499 bp,开放阅读框长270 bp,编码的蛋白质由89个氨基酸组成,5′端非编码区74 bp,3′端非编码区155 bp,具有脊椎动物典型的ACCATG起始序列.在筛选性反转雄鱼性腺差减cDNA库时检出了石斑鱼钙调蛋白基因(ECaM),用RACE-PCR方法获得了该基因的全长cDNA片段.该基因cDNA全长为582 bp,开放阅读框长450 bp,编码的蛋白质由149个氨基酸组成,5′端非编码区74 bp,3′端非编码区58 bp.虚拟Northern杂交表明,ECaM在性反转雄鱼性腺中表达,而在正常雌鱼性腺中表达微弱.运用半定量RT-PCR技术考察了其在石斑鱼不同组织中的mRNA的转录水平,结果显示ECaM在脑、心、肝、脾、肾都有转录,在精巢和下丘脑中转录水平较高,而在肌肉中转录甚弱.性反转不同时期性腺的半定量RT-PCR及Western杂交表明,性逆转过程中性腺里ECaM的表达量上调.本研究结果提示钙调蛋白可能在赤点石斑鱼性逆转过程中发挥着作用,ECaM可能是促使石斑鱼由雌向雄转变的重要功能基因之一.用PCR方法从赤点石斑鱼下丘脑中克隆到Sox9基因的完全编码区,并研究其时空表达模式.Sox9 cDNA开放阅读框长1.44kb,编码479个氨基酸,其中104-169间的氨基酸为HMG盒.RT-PCR分析显示在心脏等4种组织中检测不到转录本,而在4种脑组织中可检测到不同强弱的转录本,呈现出很强的中枢神经系统特异性;在正常雌鱼性腺和性反转雄鱼性腺中均能检测到转录本的存在,表现出性腺特异性.这些结果提示Sox9基因可能在石斑鱼的中枢神经系统发育和性腺分化过程中起重要作用.

目录

文摘

英文文摘

前言

本研究用到的主要实验仪器

第一章赤点石斑鱼性逆转前后抑制性差减杂交cDNA(SSH cDNA)文库构建及差异表达克隆的筛选

摘要

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2常用溶液的配制

2.3实验方法和步骤

3结果与分析

3.1总RNA的提取与mRNA的纯化

3.2 SMART cDNA的合成

3.3抑制性差减杂交

3.4 PCR筛选差减文库

3.5斑点杂交分析

3.6差异cDNA片段的序列分析

4讨论

5小结与展望

参考文献

第二章赤点石斑鱼一氧化氮合酶蛋白抑制剂基因(EPIN)的克隆及其表达分析

摘要

1引言

2材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1石斑鱼的成功性反转及血液中激素浓度变化

3.2差减基因EPIN的检出

3.3 EPIN的核苷酸序列和推测的氨基酸序列

3.4同源性分析

3.5 EPIN基因的生物信息学分析

3.6石斑鱼性反转不同时期性腺组织和性反转雄鱼不同组织中EPIN的转录水平

3.7表达EPINcDNA的克隆和鉴定

3.8重组表达载体pET-EPIN的构建

3.9重组质粒pET-GST-EPIN的克隆和筛选

3.10 PIN的表达分析

3.11 IgG的滴定

3.12表达产物的免疫学分析

3.13 Western印迹分析性反转不同时期性腺中EPIN的表达

3.14 EPIN基因的免疫组化分析

4讨论

5小结与展望

参考文献

第三章赤点石斑鱼钙调蛋白基因(ECaM)的克隆及其表达分析

摘要

1引言

2材料和方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1差减基因ECαM的检出

3.2 ECαM的cDNA全长序列及推测的氨基酸序列

3.3同源性分析

3.4 ECαM基因的生物信息学分析

3.5石斑鱼性反转不同时期性腺组织和性反转雄鱼不同组织中ECαM的转录水平

3.6表达ECαMcDNA的克隆和鉴定

3.7重组表达载体pET-ECaM的构建

3.8重组质粒pET-GST-ECaM的克隆和筛选

3.9 ECαM的表达分析

3.10表达产物的免疫学分析

3.11Western印迹分析性反转不同时期性腺中ECαM的表达

4讨论

5小结与展望

参考文献

第四章赤点石斑鱼Sox9基因的克隆及其特征分析

摘要

1引言

2.材料与方法

2.1材料

2.2方法

3结果与分析

3.1石斑鱼下丘脑SMART cDNA合成

3.2 Sox9的扩增及鉴定

3.3 Sox9的编码区序列及其推断的氨基酸序列

3.4同源性分析

3.5 Sox9基因的生物信息学分析

3.6不同组织中Sox9基因的转录水平

4讨论

5小结与展望

参考文献

文献综述之一鱼类性别决定的遗传基础研究概况

1.引言

2.发育和细胞事件

3.性腺分化

4.性别决定机制

参考文献

文献综述之二抑制性差减杂交技术研究进展

参考文献

致谢

附录

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