半滑舌鳎性腺差异表达基因的克隆鉴定与表达分析

摘要

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一个优良的高效海水养殖品种。但半滑舌鳎雌、雄个体差异巨大，并且雄性个体生殖能力弱，因而导致繁殖能力差。因此开展性别调控，提高受精效率为主的繁殖生物学研究对于提高半滑舌鳎的养殖效率，增加养殖产量和经济效益，都有重要意义。近几年来，有关半滑舌鳎繁殖生物学的研究已全面展开，但仅限于组织学和胚胎学的研究，在基因水平上研究还未见报到，因此研究半滑舌鳎雌雄性腺的差异表达基因谱不仅对于研究造成其雌、雄发育差异的机制，研究鱼类性别决定和分化的过程有着重要的理论意义而且有利于探索半滑舌鳎性别调控以及提高受精效率的新方法。本文采用SSH的方法，建立了半滑舌鳎成体鱼卵巢与精巢的差减cDNA文库，通过筛选鉴定与测序获得了41个性腺差异表达的非重复克隆，进而通过RACE技术克隆了其中5个基因，并对其进行了序列特征和时空表达分析。此外还通过同源克隆的方法克隆了在精巢中特异表达的DMRTI基因，并对其进行了组织表达分析。 以成体半滑舌鳎卵巢作为检测子(tester)，成体鱼的精巢作为驱赶子(driver)，分别提取总RNA，逆转录合成双链cDNA。经两轮差减杂交，两轮抑制性PCR扩增后，取差减的PCR产物与T载体连接，构建抑制差减cDNA文库，随机挑取2000余个克隆，对其中1000多个克隆进行PCR扩增鉴定，发现近600个克隆中均含有插入片段，大小在250-2000bp之间，进一步对含有插入片段的近600个克隆进行了斑点杂交筛选，得到196个性腺差异表达的阳性克隆，经测序共获得166阳性克隆的结果，共41个非重复的克隆，其中已知基因20个未知基因21个。 利用RACE技术成功克隆到了半滑舌鳎的zp3α、Aquaporinlo、survivin、PABP和RacGAP1这5个与生殖相关的基因，这些基因在半滑舌鳎中都是首次被克隆鉴别。ZP3蛋白是卵膜的组成成分之一，其在卵子形成和受精中起到重要作用。在差减文库中筛选并克隆了—ZP3亚家族的成员，命名为zp3α，该亚家族中的另外一成员在本实验构建的全长cDNA文库中获得，命名为zp3b。两者的cDNA全长分别为1638bp和1135bp，开放阅读框分别编码518和312个氨基酸的蛋白质。序列比对及系统进化分析均表明两者属于ZP3亚家族。RT-PCR分析表明，二者在卵巢中大量表达，同时也在其它一些雌性的组织中有低量表达，有意思的是zp3bmRNA也在精巢和雄性的肾脏中被检测到。Aquaporinlo主要在卵巢中表达，与海水鱼类卵子成熟吸水排卵有关。在差减cDNA文库中克隆了半滑舌鳎的Aquaporinlo基因，同时通过同源克隆的方法克隆了非卵巢特异表达的Aquaporinl基因，二者的cDNA全长分别为993bp和1335bp，开放阅读框分别编码262和261个氨基酸的蛋白质。RT-PCR分析表明Aquaporinlo仅在卵巢中大量表达在雌性的肾脏中微量表达，Aquaporinl在雌性和雄性的多种组织中均有表达。Survivin是一种细胞凋亡抑制因子，其在卵子形成和胚胎发育中具有重要作用。克隆了半滑舌鳎的survivin基因，序列分析表明该基因cDNA全长704bp，开放阅读框编码147个氨基酸的蛋白质，该蛋白包含一个BIR结构域。RT-PCR分析表明该基因主要在卵巢中表达，随着胚胎发育表达逐渐减少，这可能表明该基因在半滑舌鳎卵子形成和早期胚胎发育中起到重要作用。ePABP是特异的在卵巢和早期胚胎表达的Poly(A)结合蛋白。从差减文库中克隆了-PABP因，序列分析及RT-PCR分析组织及胚胎发育时期的表达，初步认为该基因可能为与其它物种的ePABP2因同源。RacGAP1是小G蛋白Rac重要的调控因子，在调节细胞骨架，细胞移动，细胞周期调控以及细胞凋亡方面起重要作用。从差减文库中克隆了一主要在卵巢中表达的RacGAP1基因，这是第一次发现主要在卵巢中表达的RacGAP1基因，组织表达及胚胎发育的表达分析，可能暗示该基因在卵子形成和胚胎发育中起重要作用。 利用同源克隆的方法克隆了半滑舌鳎的DMRT1基因，该基因cDNA序列全长1232bp，编码258个氨基酸的蛋白质。RT-PCR分析表明，DMR71基因在半滑舌鳎早期胚胎不同发育时期和孵化后5天、13天、18天、22天和35天的仔鱼均有表达，在孵化后22天表达量最高。在成体鱼中只在雄性精巢中有特异表达，其他组织均无表达，表明该基因可能参与半滑舌鳎雄性性腺的发育或精子的形成。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章文献综述

1鱼类生殖生理学的研究进展

1.1性腺的发育

1.2性腺的结构和组织学分期

2鱼类的性别决定与性别控制

2.1鱼类性别决定的细胞遗传基础研究现状

2.2鱼类性别决定的分子细胞学与分子遗传学研究概况

3抑制消减杂交(SSH)及其在鱼类基因克隆中的应用

3.1抑制消减杂交的原理及步骤

3.2抑制消减杂交的优缺点

3.3抑制消减杂交在鱼类基因克隆中的应用

4本研究的目的、意义及实验设计

第二章半滑舌鳎卵巢与精巢差减cDNA文库的构建及评价

1材料与方法

1.1实验动物

1.2半滑舌鳎不同组织的总RNA的提取

1.3总RNA中DNA的消除

1.4改良的SSH实验流程

2结果与分析

2.1卵巢和精巢总RNA及质量评价

2.2 cDNA合成及酶切纯化

2.3两次抑止性PCR

2.4消减杂交效果验证

3讨论

第三章差减cDNA文库的筛选，鉴定及差异表达基因的表达模式分析

1材料与方法

1.1差减cDNA质粒文库克隆的PCR筛选

1.2斑点杂交筛选

1.3序列测定、序列分析及功能注释

1.4 RT-PCR鉴定差异表达基因在不同组织中的表达

2结果与分析

2.1差减cDNA文库容量及文库中插入片段大小

2.2斑点杂交

2.3差减cDNA片断的序列测定和分析

2.4 RT-PCR研究差异表达基因在不同组织中的表达

3讨论

第四章半滑舌鳎卵巢生理功能相关基因全长cDNA的克隆、鉴定及表达分析

第一节半滑舌鳎两种zp基因的克隆，鉴定及表达分析

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第二节半滑舌鳎两种Aquaporinl基因的克隆与表达分析

1材料与方法

2结果与分析

3讨论

第三节半滑舌鳎的一种细胞凋亡抑制因子的克隆、鉴定与分析

1材料和方法

2结果

3讨论

第四节半滑舌鳎PABP基因的克隆及表达分析

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第五节半滑舌鳎RacGAP1基因的克隆、鉴定及表达分析

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

第五章半滑舌鳎DMRT1基因的克隆与表达分析

1材料和方法

1.1材料

1.2方法

2结果

2.1半滑舌鳎DMRT1的克隆

2.2同源性比较

2.3 DMRT1在半滑舌鳎不同发育时期以及雌雄成鱼不同组织的表达

3讨论

小结

参考文献

个人简介

发表论文和完成论文

致谢