小干扰RNA表达载体抑制子宫颈癌HPV16 E7基因的研究

摘要

背景与研究目的高危型HPV感染在宫颈癌的发生发展中起着至关重要的作用，特别是E6/E7癌基因，已被证实有恶性转化能力，因此它们已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它比反义寡核苷酸和核酶技术能更高效的抑制目的基因的表达。已有研究证实化学合成的siRNA(smallinterferingRNA)能高效地介导RNAi作用，但作用持续时间短，而采用siRNA表达载体(smallinterferingRNAexpressionvector)的方法可能延长作用时间。因此本研究旨在探讨HPV16E7特异性siRNA表达载体对宫颈癌Caski和SiHa细胞E7基因的沉默作用及作用持续时间，以及体内外对肿瘤细胞生长的影响，探索siRNA表达载体作为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。 方法1.利用计算机辅助设计软件，设计合成了含不同HPV16E7特异性序列的56nt寡核苷酸片段，并将其定向克隆入真核表达载体psiRNA，得到重组质粒P1、P2、P3；2.利用脂质体将重组质粒转染CaSki和SiHa细胞，以荧光定量RT-PCR检测不同时间点转染前后E7mRNA的变化，以免疫荧光标记法、westernblot检测转染前后E7蛋白的变化；3.以流式细胞仪、MTT检测重组质粒P1和空质粒PO转染CaSki和SiHa细胞后细胞周期及细胞增殖的变化；4.将重组质粒P1转染CaSki细胞后，接种到裸鼠皮下，观察体内致瘤活性及生长情况；免疫组化检测瘤体HPV16E7蛋白的表达。 结果1.利用PCR分析，DNA测序证实HPV16E7特异性siRNA表达载体P1、P2、P3已成功构建。 2.重组质粒P1、P2、P3转染CaSki细胞，抗性克隆形成后1周，它们对E7mRNA抑制率分别为92.86％，54.24％，87.22％；对E7蛋白的抑制率分别为84.21％，44.66％，83.46％。重组质粒P1对CaSki细胞E7基因的抑制作用更有效。 3.重组质粒P1、P2、P3转染SiHa细胞，抗性克隆形成后1周，它们对E7mRNA抑制率分别为92.15％，54.51％，87.22％；对E7蛋白的抑制率分别为84.30％，41.65％，82.91％。重组质粒P1对SiHa细胞E7基因的抑制作用更有效。 4.重组质粒P1转染CaSki和SiHa细胞抗性克隆形成后4周，对E7mRNA抑制率分别为68.95％、65.69％，对E7蛋白的抑制率分别为62.50％、59.11％。 5.重组质粒P1转染CaSki和SiHa细胞抗性克隆形成后1周，与未转染组相比，G1期细胞比例明显增多，S期细胞比例明显降低。重组质粒P1体外能抑制CaSki和SiHa细胞的增殖。 6.重组质粒P1使宫颈癌CaSki细胞裸鼠体内成瘤时间延长，细胞生长减慢，瘤体体积及重量明显小于或轻于CaSki组及CPO组，抑瘤率为50.61％。重组质粒P1在体内能抑制CaSki细胞E7蛋白的表达，抑制率为74.75％。 结论HPV16E7siRNA表达载体能特异、高效地抑制宫颈癌CaSki和SiHa细胞E7基因的表达，作用时间至少可维持抗性克隆形成后4周，并可调控肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞的恶性增殖，部分逆转其恶性表型，有望成为宫颈癌基因治疗的合理策略之一。

目录

声明

前言

第一部分HPV16E7siRNA表达载体的构建及鉴定

材料和方法

结 果

讨 论

小结

第二部分小干扰RNA表达载体抑制宫颈癌HPV16E7基因的体外实验研究

结 果

一、宫颈癌CaSki和SiHa细胞G418的筛选浓度

二、重组质粒转染筛选后细胞的生长状况

三、荧光定量RT-PCR检测转染前后HPV16E7mRNA的变化

四、检测CaSk和SiHa细胞转染前后HPV16E7蛋白量变化

五、细胞周期的变化

六、细胞增殖的变化

讨论

小结

第三部分小干扰RNA表达载体抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的体内实验研究

结 果

讨 论

小结

全文小结

参考文献

综述一 小发夹RNA介导的基因沉默及其应用

参考文献

综述二 宫颈癌与HPV相关生物治疗

参考文献

致谢