RNA干扰表达载体抑制宫颈癌HPV16-E6基因表达的研究

摘要

目的：探讨RNA干扰表达载体(smallinterferenceRNAexpressionvector)对宫颈癌细胞中HPV16-E6基因的抑制作用，通过体外实验和雌性裸鼠体内实验了解我们构建的载体能否特异性的沉寂宫颈癌细胞中的HPV16-E6基因及其时效性。 方法： 1.利用计算机辅助设计软件，设计合成含有针对HPV16-E6基因特定序列的56nt寡核苷酸片段，并将其定向克隆入真核表达载体，得到重组质粒E6-1、E6-2、E6-3。 2.脂质体法转染宫颈癌caski和siha细胞株，经G418筛选获得阳性克隆株。应用荧光定量PCR(fluorescencequantitativePCR)技术及流式细胞仪(flowcytometry)检测转染前后及不同时间点HPV16-E6mRNA的变化、HPV16-E6蛋白表达及细胞凋亡的情况。 3.通过细胞生长曲线及克隆形成试验了解转染前后细胞生物学行为的变化。 4.裸鼠皮下接种肿瘤细胞成瘤，不同时间点测定肿瘤体积的差异，肿瘤组织切片免疫组化衡量HPV16-E6蛋白表达变化和肿瘤细胞凋亡TUNEL检测，评价体内环境中RNAi表达载体对肿瘤细胞的影响。 结果： 1.利用PCR方法鉴定重组质粒，DNA测序证实特异性针对HPV16-E6基因的RNA干扰表达载体己成功构建。 2.重组质粒E6-1、E6-2、E6-3转染CaSki细胞，经G418筛选获得阳性克隆细胞株，它们HPV16-E6mRNA的量分别相当于caski细胞的18.59％、10.43％、28.76％；蛋白表达抑制率分别为82.1％、98.1％、89.4％。重组质粒E6-2对CaSki细胞E6基因的抑制作用更有效。 3.重组质粒E6-1、E6-2、E6-3转染CaSki细胞，经G418筛选获得阳性克隆细胞株，流式细胞仪检测细胞凋亡率分别为2.9％、15.1％、12.6％。重组质粒E6-2能更明显的促进CaSki细胞的凋亡。 4.重组质粒E6-1、E6-2、E6-3转染SiHa细胞，经G418筛选获得阳性克隆细胞株，检测它们HPV16-E6mRNA的量分别相当于SiHa细胞的79.52％，87.87％，71.95％；E6蛋白的抑制率分别为24.61％、49.96％、40.01％。三个重组质粒对SiHa细胞HPV16-E6基因无明显的抑制作用。 5.重组质粒E6-2转染CaSki细胞的阳性克隆株继续培养，于第0、2、4、6、8周检测HPV16-E6mRNA的量分别相当于caski细胞的10.43％、29.27％、34.11％、48.25％、90.05％；HPV16-E6蛋白表达抑制率分别为：98.1％、87.6％、81.3％、72.5％、25.5％；细胞凋亡率分别为15.1％、11.5％、7.7％、1.7％、1.9％。重组质粒E6-2对宫颈癌CaSki细胞HPV16-E6基因的抑制效果可以维持4周以上。 6.空表达载体P0转染CaSki、siha细胞后在任何时间点对HPV16-E6mRNA、蛋白质的表达和细胞的凋亡都无明显影响。 7.细胞生长曲线和平板克隆形成试验结果显示重组质粒E6-2能明显抑制CaSki细胞的增殖，空表达载体P0对细胞的增殖无明显影响。 8.重组质粒E6-2使宫颈癌CaSki细胞体内成瘤时间延长，肿瘤体积及重量明显小于空白对照组和空质粒组，免疫组化显示HPV16-E6蛋白表达明显受抑，肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加。 结论：RNAi表达载体对外源性的HPV16病毒E6基因进行干扰是成功的，体内和体外实验均表明RNAi表达载体对HPV16-E6基因的抑制效果具有特异性和高效性，抑制效果可以维持4周以，有望成为宫颈癌基因治疗的合理策略之一。

目录

声明

前言

第一部分：RNAi表达载体的构建

结果

讨论

第二部分：RNAi表达载体抑制宫颈癌细胞株HPV16-E6基因表达的体外实验研究

结果

讨论

第三部分：RNA干扰表达载体抑制宫颈癌HPV16-E6基因的体内实验研究

结果

讨论

附图

参考文献

综述：RNA干扰技术及其在妇科肿瘤领域的应用进展

参考文献

致谢