mBD2与HA1融合基因真核表达载体的构建及其免疫保护性研究

摘要

甲型流感病毒曾在世界上多次发生大规模的流感暴发流行，目前对流感尚无特效药物进行治疗，接种流感疫苗是易感者预防流感的最佳选择，核酸疫苗是当前流感疫苗研究的方向与热点。流感病毒血凝素(hemagglutinin．HA)是流感病毒的主要保护性抗原，能刺激机体产生中和性抗体，此类抗体具有中和病毒和防止病毒进入靶细胞的作用，可中断病毒的复制。HA由HA1重链和HA2轻链相连构成。HA的5个抗原决定簇主要都位于HA1区，因而流感亚单位疫苗的靶标就首选HA1区。小鼠β-防御素2(mBD2)是一种内源性的抗菌肽，对非成熟的DC细胞具有趋化作用，能活化APC，增强机体的免疫作用，因此可以作为一种天然的免疫佐剂。 本研究的目的:构建mBD2与HAl融合的真核表达载体(pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1)，并检测其在HEK293细胞中的表达，观察pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1免疫小鼠后对流感病毒攻击的保护力，研究mBD2作为免疫佐剂的可行性。 方法:用PCR技术分别从构建好的质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增出mBD2与HAl基因片段，再用重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将mBD2与HA1通过一段柔性多肽接头Gly<,4>Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)，转化感受态E coli JM109并筛选阳性克隆。经酶切、PCR和测序鉴定正确后，用脂质体将重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1转染HEK293细胞，用课题组制备的兔抗流感病毒血清作为一抗，FITC荧光素标记的羊抗兔IgG为二抗，通过免疫荧光检测融合蛋白的真核表达情况。为了研究重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1对甲型流感病毒的免疫保护作用，我们以SPF级BALB/c小鼠为实验动物，用pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1、pcDNA3.1(+)/HA1和pcDNA3.1(+)质粒DNA分别免疫小鼠，一共免疫两次，每次间隔三周。在第二次加强免疫前，用断尾法从小鼠尾部取血；第二次免疫后10d(病毒攻击后3d)，再次取血，并收集血清检测抗.HA抗体。加强免疫后一周，用致死量(10×LD50)滴鼻攻击小鼠，观测动物的体重变化及存活率。综合以上几个方面评价重组质粒的免疫保护效果。 结果:PCR法分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增出了mBD2与HA1基因片段，并且用重叠延伸PCR法成功将mBD2与HAl通过一段柔性多肽接头Gly<,4>Ser融合为mBD2-HA1。重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1经双酶切电泳后出现大小约1.2kb的目的条带,PCR鉴定也出现了相同大小的条带，目的片段经测序和将测序结果进行Blast比对，证实了克隆片段是正确的。免疫荧光检测结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1体外实验能够在HEK293细胞中表达mBD2-HA1的融合蛋白。动物实验结果表明，pcDNA3.1(+)空质粒对照组的小鼠7d内全部死亡，pcDNA3.1(+)/HA1免疫组的小鼠保护率为50％，而pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1组的小鼠保护率为90％；与单独免疫pcDNA3.1(+)/HA1相比，mBD2-HA1融合基因DNA免疫小鼠后，诱导出了更高的抗-HA抗体，保护率也更高，并且体重丢失明显减少。 结论:本研究成功构建了mBD2-HA1融合基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1，该质粒能在真核细胞中表达融合蛋白；经动物实验表明，pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1重组质粒DNA免疫实验动物后，能够为抗流感病毒攻击提供很好的保护力，其保护效果明显高于pcDNA3.1(+)/HA1免疫组。本研究结果初步表明：小鼠β防御素2可以作为一种免疫佐剂用于流感病毒的DNA疫苗中。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

第一部分 mBD2与HA1融合基因真核载体的构建与表达

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

第二部分 真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1的免疫保护作用研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

全文总结

参考文献

文献综述：防御素抗HIV作用

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