非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)胰岛素抵抗机制的实验研究

摘要

目的: 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFID)是一种代谢相关性疾病，随着国人生活水平的提高和饮食结构的改变，我国NAFLD发病率持续明显上升，已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。NAFLD疾病谱包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化和肝硬化，其中NASH是该病发展的的中心环节，是发展为肝纤维化和硬化的必经阶段．目前有关NAFLD的发生机制尚未阐明，学者们普遍认为胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)作为肝脏的“二次打击”是NAFLD发生的关键环节之一，迄今有关NAFLD发生和进展过程中IR的发生和维持的分子机制尚未阐明。本研究拟建立NAFLD大鼠实验模型，研究NAFLD胰岛素抵抗(IR)的主要相关靶器官或组织、血生化变化特点；探讨NAFLD发生与进展过程中IR的作用和分子机制，为NAFLD的防治提供依据。 方法: 建立高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型，组织病理学结合血生化检测对所建立的模型进行评价；利用稳态HOMA_IR、HOMA_β、DI模型对NAFLD实验模型进行IR的动态观测。为研究NAFLD IR的主要靶部分及分子机制，应用免疫组织化学方法观测胰腺、肝脏及腹部组织胰岛素信号蛋白的表达情况，并观测代谢调节蛋白SREBP-1c、PPARγ、GLUT-4、SOCS-3的表达，同时检测胰腺组织的PCNA及Fas-L的表达，以观测胰岛的增生及凋亡水平，应用原位分子杂交技术检测肝脏组织ISR及GLUT4的mRNA表达水平。 结果: 1．组织病理学评价，所建立的实验大鼠NAFLD模型6-8w呈现典型的肝脏NASH改变，至造模12w呈现典型的肝纤维化的表现，病变特点和阶段性与人体NFLD比拟性良好。 2．血生化分析：与对照组相比，HOMA_IR、HOMA_β均在造模2w开始增加，且随着造模时间的延长，呈现上升趋势，分别在12w、8w达高峰，而DI水平在模型组呈下降趋势。血清TC、ALT、GGT水平分别与IRI呈相关性(P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01)。 3．IR相关靶器官和组织观测： (1)胰腺观测： 1)β细胞胰岛素的表达水平呈上升的态势，在造模6w时表达显著升高； 2)在NAFLD的发生和发展过程中，β细胞的增生及凋亡共存，PCNA在造模2w时表达明显增多，Fas-L在造模8w表达明显增强． 3)胰腺ISR、IRS在造模早期变化不明显，6w时表达显著降低，且与血清。TNFα、瘦素负相关(P＜0.05)；而胰岛AKT在造模2w开始表达明显增多； 4)SOCS-3在胰岛呈弥漫性表达，PPARγ主要分布在胰岛中央部，分别在造模2w、4w时表达明显上调，二者均与ISR、IRS的表达水平负相关(P＜0.05)。 (2)肝脏观测： 1)肝脏ISR、IRS的阳性细胞以中央静脉周围为著，分别在造模6w、8w时表达明显减少。ISRmRNA的表达先升高，在造模6w时达高峰后降低。 2)GLUT-4的蛋白表达变化与其mRNA的变化趋势相一致，分别在造模4w、6w时表达明显减少，并均与瘦素呈相关性(P＜0.05)。 3)SOCS-3主要表达在中央静脉周围，造模2w表达上调，造模6w达高峰，且与IRS负相关(P＜0.05)。 4)肝脏SREBP-1c及PPARγ的表达均增多，前者以中央静脉周围为著，后者以汇管区周围为著，分别在造模2w、8w表达明显增加。 (3)腹部脂肪组织观测： 1)ISR、IRS、GLUT-4表达均降低，分别在造模6w、6w、8w时出现显著性变化，且与血清TNFα水平负相关(P＜0.05)； 2)SOCS-3、SREBP-1c、PPARγ表达均增强，分别在2w、2w、6w时出现显著性变化，其中SOCS-3与IRS负性关(P=0.05)； SREBP-1c与血清脂联素、HDL、TC呈相关性(P＜0.05)。 结论: 1．成功制备具有IR的NAFLD大鼠实验模型，主要病理学改变、血生化变化与人体NAFLD比拟性良好，为NAFLD的发病机制的探讨和药物的实验研究提供良好的实验模型； 2．研究发现NAFLD大鼠在疾病过程中出现胰腺胰岛β细胞的分泌亢进、β细胞增生，是NAFLD发生与进展过程中IR的适应性改变；而胰岛β细胞的凋亡推测可能为β细胞的过分泌及增生后的衰退性表现。 3．NAFLD大鼠胰腺组织存在胰岛素信号蛋白ISR、IRS表达减少，脂源性激素TNFα、瘦素和SOCS-3可能对胰岛素信号蛋白具有负性调节作用，同时诱导胰腺组织PPARγ表达上调，推测为NAFLD病理过程中机体的一种负反馈的调节机制。 4．动态观测结果显示，NAFLD模型肝脏及腹部脂肪组织均发生IR，表现多种胰岛素信号蛋白表达变化，其中ISR变化最早、且显著，而PI3K的改变相对较迟，SOCS-3在肝脏、脂肪及胰腺组织中表达变化均较早，并与TNFα的表达相平行，肝脏及脂肪组织GLUT-4的表达均减少，尤以在肝脏表达改变为突出，上述多种胰岛素信号蛋白或调节分子在NAFLD模型发生和进展过程中的变化特点显示，多种胰岛素信号蛋白或调节分子参与了NAFLD IR的发生和维系，提示对其关键性环节的干预是改善NAFLD胰岛素敏感性，进行NAFLD防治的有效策略。 5．相关性分析结果显示，血清GGT水平与多种NAFLD发生中的指标IRI、TNFα、瘦素、HDL等具有相关性，尤其与IRI关系密切，提示GGT有可能是反映NAFLD IR的指标之一。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分胰岛素抵抗NAFLD大鼠模型的建立及血清学特点分析

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第二部分NAFLD大鼠胰腺组织IR发生机制的实验研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

第三部分NAFLD大鼠肝脏及脂肪组织IR发生机制的研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

参考文献

全文小结

综述 胰岛素信号途径的负性调节因子

发表和待发表论文的情况

发表论文一

发表论文二

个人简历

致谢