转基因山羊乳中rhEPO的分离纯化及性质鉴定

摘要

本论文以转基因羊乳为原料进行了纯化EPO的工艺研制,取得了一定成果.首先,对rhEPO转基因母山羊进行了催乳表达,并监测泌乳量,进行体内、体外EPO生物活性的分析.结果显示:两只母山羊为高表达的转基因山羊.对其中一只高表达的山羊跟踪监测显示:活性表达曲线波动不大,平均为16852IU/ml;泌乳量大,诱导泌乳量平均55ml/天,优于CHO表达系统.其次,建立了两种用于转基因羊乳中rhEPO分离纯化的方法.Ⅰ,设计出一套完整快速的纯化方案,包括预处理(脱脂和调pH至4.6离心除去酪蛋白)、离子交换、疏水层析和分子筛层析.该方法用于转基因羊乳中rhEPO的纯化,活性回收率为10.1%,样品纯度用SDS-PAGE测定为一条带.Ⅱ,建立了免疫亲和层析纯化转基因羊乳中rhEPO的方法,包括成功制备和纯化抗rhEPO的单克隆抗体(获得了两株能稳定分泌抗rhEPO的单克隆抗体,亚型分别为IgGl和IgG2b),取其中一株纯化后的抗体与CNBr活化的Sepharose 4B偶联制备了免疫亲和柱,用于纯化转基因羊乳中的rhEPO.此外,对通过不同纯化路线获得的纯品rhEPO不但进行了生物活性(体内、体外)和唾液酸含量测定等性质鉴定,还进行了包括分子量、等电点、N-端测序等的分析.本研究获得的成果不仅对利用乳腺生物反应器生产药用蛋白具有指导意义,而且将大大推动利用转基因山羊乳生产药用rhEPO的产业化进程,带来巨大的经济效益.

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白的研究进展

1.1.1外源基因导入细胞的方法

1.1.2构建表达载体

1.1.3最新发展的新载体

1.1.4转基因动物乳腺生物反应器的鉴定

1.1.5转基因动物奶液中目的蛋白的分离与纯化

1.2红细胞生成素的研究进展

1.2.1 EPO的结构及生化特性

1.2.2 EPO的生理功能

1.2.3 临床应用及市场现状

1.2.4 EPO表达与制备

1.3课题研究背景、意义及主要内容

1.3.1研究背景及意义

1.3.2主要研究内容

第二章rhEPO转基因山羊泌乳量及羊乳活性检测

2.1材料和方法

2.1.1材料

2.1.2方法

2.2结果与讨论

2.2.1转基因山羊的泌乳量数据

2.2.2 rhEPO转基因山羊乳的体外活性检测结果

2.2.3 134转基因山羊的泌乳表达曲线

2.2.4催乳前3天羊奶体外活性检测结果

2.2.5羊乳生物活性(体内、体外)检测结果比较

2.2.6 Western-blot结果

2.3本章结论

第三章转基因山羊乳中rhEPO层析纯化方法的研究

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与讨论

3.2.1羊乳预处理

3.2.2离子交换层析

3.2.3疏水层析

3.2.4分子筛层析

3.2.5各步分离纯化得到的样品纯度鉴定

3.2.6回收率的测定

3.3本章结论

第四章抗rhEPO单克隆抗体和rhEPO亲和层析柱的制备及其应用

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与讨论

4.2.1杂交瘤细胞系的建立

4.2.2 mAb腹水的纯化

4.2.3单抗性质鉴定

4.2.4亲和层析纯化羊乳中的rhEPO

4.3本章结论

第五章rhEPO性质鉴定

5.1材料与方法

5.1.1材料

5.1.2方法

5.2结果与讨论

5.2.1 N-端测序结果

5.2.2分子量测定结果

5.2.3免疫原性测定结果

5.2.4等电点测定

5.2.5生物活性检测

5.2.6唾液酸含量测定结果

5.3本章结论

主要结论与建议

参考文献

附录一：缩写词表

附录二：常用试剂配方

附录三：糖蛋白及其糖基化的研究进展

致谢