转人α-乳白蛋白基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及转基因奶山羊的鉴定

摘要

α-乳白蛋白（alpha-lactalbumin，α-LA）是乳清蛋白中主要的钙结合蛋白，同时还是乳糖合成酶的一个亚基，控制着乳糖的合成。α-LA能提高机体免疫力，有较高的营养价值，在人乳中含量约为2.9mg/mL，但在羊乳中含量较低，因此通过转基因的方法提高羊乳中α-LA的水平，可提高羊乳的价值。本研究应用基因克隆、细胞培养、脂质体转染、PCR和Western-blot等技术建立了转α-LA基因的奶山羊胎儿成纤维细胞株（Goat fetal fibroblast cells，gFFCs），为制备转基因克隆奶山羊提供了供核细胞;同时应用TAIL-PCR、RT-PCR和Western-blot技术对本实验室制备的转人α-LA基因奶山羊进行了鉴定。
　　(1)含调控序列的人α-LA全基因克隆及其表达载体构建。
　　以人基因组为模板，扩增含5'调控区和部分3'调控区的人α-LA全基因序列，将其克隆到pMD19-T载体上，构建克隆载体PLAT;酶切质粒B9获得载体片段NI3A（含Neo-IRES-EGFP共表达序列作为筛选标记基因，1.7kb3'βLG作为3'调控序列），酶切PLAT获得PLA，将二者连接得到乳腺特异性表达载体PLAN，经酶切及测序鉴定均正确。采用脂质体转染法将PLAN瞬时转染至奶山羊胎儿成纤维细胞，转染细胞有绿色荧光蛋白表达。
　　(2)真核表达载体PLAN在山羊乳腺上皮细胞中的诱导表达及人α-LA检测。
　　采用脂质体Lipofectamin TM LTX Reagent+PLUSTM Reagent介导转染法，以本实验室保存的转基因载体5A和NI3A为对照，将表达载体PLAN转染进山羊乳腺上皮细胞。经含胰岛素（10μg/mL）、催乳素(5μg/mL)及氢化可的松（10μg/mL）的DMED/F12培养液诱导培养，分别在转染24h、48h和72h收集上清液，Western blot检测其α-LA的表达情况。结果显示诱导培养液中有目的蛋白表达，分子量约为14kD，表明本实验所构建的转基因载体能够在山羊乳腺细胞诱导表达α-LA，为后续乳腺生物反应器的研究奠定了基础。
　　(3)整合含调控序列人α-LA基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的筛选。
　　采用脂质体Lipofectamin TM LTX Reagent+PLUSTM Reagent介导转染法，将线性化的PLAN转进奶山羊胎儿成纤维细胞中。用1000μg/mL G418抗性筛选1周，500μg/mL G418筛选2周，结合EGFP挑选出绿色荧光克隆扩大培养;经巢式PCR扩增鉴定，筛选得到的细胞株均已成功整合目的基因。结果表明，本实验得到的转基因细胞株可以为制作转基因克隆奶山羊提供供核细胞。
　　(4)转人α-LA基因奶山羊的鉴定。
　　用TAIL-PCR的方法获得转基因插入序列5'端和3'端已知序列邻近的未知序列;用RT-PCR和Western-blot检测乳腺上皮细胞中mRNA和羊乳中α-LA的表达情况。切胶回收TAIL-PCR产物，将测序结果与已知序列和奶山羊基因组序列比对，结果显示外源基因同源重组整合进了目的位置;转人α-LA基因克隆羊羊乳中检测到了α-LA，且表达量接近人乳，表明其基因组成功整合了人α-LA基因，且乳腺能够合成并分泌人α-LA。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词(Abbreviation)

第一章 动物转基因技术

1．转基因动物研究方法

1．1 体细胞核移植介导法

1．2 精原干细胞法介导法

1．3 转座子介导法

1．4 RNA干扰介导法

1．5 诱导多能干细胞(iPS 细胞)介导法

2．转基因克隆动物研究发展现状

3．转基因动物的应用

3．1 转基因技术在哺乳动物遗传育种中的应用

3．2 转基因技术在生物制药中的应用

3．3 转基因技术在建立动物模型和器官移植等医疗中的应用

4．转基因技术存在的问题

参考文献

第二章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展

1．动物乳腺生物反应器原理

2．乳腺特异性表达载体

2．1 乳腺特异性表达载体调控元件

2．2 常用表达载体

3．动物乳腺生物反应器的应用

3．1 生物医药生产

3．2 改变乳汁成分，提高营养价值

4．动物乳腺生物反应器存在的问题

4．1 外源基因在乳腺中特异性表达问题

4．2 外源基因在动物基因组中的整合问题

4．3 目的蛋白的翻译后修饰问题

4．4 对生态平衡的影响问题

5．α-LA研究进展

5．1 α-LA结构特性

5．2 α-LA生理功能

5．3 重组α-LA研究进展

参考文献

第三章 人α-LA调控序列克隆、转基因载体构建

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 真核载体PLAN的构建

1．4 质粒PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达

2．结果与分析

2．1 含调控序列人α-LA基因克隆及鉴定

2．2 PLAN真核表达载体的构建与鉴定

2．3 质粒PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达

3．讨论

参考文献

第四章 真核表达载体PLAN在山羊乳腺上皮细胞中的表达

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 GMEC纯化与扩大培养

2．2 GMEC脂质体转染

2．3 Western-blot检测

3．讨论

参考文献

第五章 整合含调控序列人α-LA基因奶山羊胎儿成纤维细胞株的筛选

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 真核载体PLAN转染gFFCs后报告基因EGFP的表达

2．2 转基因阳性gFFCs克隆的PCR鉴定

3．讨论

参考文献

第六章 转人α-LA基因奶山羊的鉴定

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果与分析

2．1 RT-PCR检测

2．2 TAIL-PCR检测

2．3 测序结果分析

2．4 羊乳乳清蛋白总量的测定

2．5 羊乳乳清中人α-LAWestern-blot检测

3．讨论

参考文献

全文结论

附录

致谢

作者简介