鱼类主要过敏原小清蛋白的单克隆抗体制备及其金磁酶联免疫体系的构建

摘要

鱼类及其制品含有丰富的营养，同时也是FAO及WHO认定的导致人类过敏的八大类食物之一。其中鱼肉中的小清蛋白（parvalbumin，PV）被视为主要的过敏原，因此开展针对鱼类及其制品中小清蛋白强特异性、高灵敏度的检测具有重要的理论和现实意义。
　　本文研究主要包括小清蛋白单克隆抗体的制备及鉴定、金磁复合纳米微粒与酶标抗原的制备以及小清蛋白金磁酶联免疫检测方法的建立。具体研究内容如下：
　　鱼类主要过敏原小清蛋白的制备
　　使用硫酸铵分级沉淀法，从新鲜的鲫鱼鱼肉中提取、纯化过敏原小清蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳表征过敏原小清蛋白的纯度，最后冻干样品后保存于-20℃冰箱备用。
　　2、小清蛋白单克隆抗体的制备
　　以高纯度的PV免疫4只BALB/c小鼠，利用间接ELISA方法测小鼠抗血清效价，获取效价最高的小鼠（PV效价为1：256000）。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合，获得杂交瘤细胞。间接ELISA方法筛选阳性孔，有限稀释法进行3次亚克隆得到分泌同质的杂交瘤细胞株。采用小鼠体内诱生腹水法大量制备单抗。
　　3、小清蛋白单克隆抗体的鉴定
　　采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单抗腹水，SDS-PAGE凝胶电泳表征单克隆抗体纯度，并采用Western-blotting、考马斯亮蓝染色法分别检测单抗特异性及抗体浓度，结果显示 PV单克隆抗体具备良好的特异性，并且单抗浓度为300ug/mL，最后通过商业化试剂盒检测PV单抗亚类为IgG1型。
　　4、金磁（Fe3O4/Au)复合微粒与酶标抗原的制备
　　采用一锅法制备氨基化的磁性微粒Fe3O4-PEI，之后在其表面包覆两层Au颗粒，制备金磁（Fe3O4/Au)复合微粒，金磁复合微粒形貌呈圆形，粒径均一，粒径约150nm。采用过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记PV，用于后面金磁酶联免疫体系的建立。
　　5、金磁酶联免疫法检测过敏原小清蛋白体系的建立
　　按照最佳条件制备得到金磁免疫探针和PV酶标抗原后，将它们与PV标准溶液竞争结合建立金磁酶联免疫检测体系，初步探究了该体系在鱼类及其制品中检测小清蛋白的可行性。研究结果显示PV浓度5.5-289ng/ml范围内，PV浓度对数与抑制率有良好的线性关系，标准曲线为y=34.96x-6.0357，R2=0.9979；IC50为40.1ng/mL，LOD为2.8ng/mL。此外，对该检测体系进行方法学评价，包括精密度、特异性、稳定性。结果显示该方法对PV检测的批内变异系数在4.3％-9.6%之间，批间变异系数在5.5%-11.7%之间；该方法与食品中其他主要过敏原蛋白交叉反应率都小于1%，具有良好的特异性，并且金磁探针的稳定性在15天左右。此金磁酶联免疫法可以提高检测的灵敏度和特异性，在食品安全检测中有重要的实际应用价值。

目录

主要符号表

第1章 绪论

1.1 食品过敏与过敏危害

1.2 鱼类过敏及其主要过敏原

1.3 食品过敏原检测技术研究现状

1.4 金磁纳米材料及在生物检测中的研究现状

1.5 酶标抗原在生物检测中的研究现状

1.6 本课题的研究目的和主要内容

第2章小清蛋白过敏原的制备

2.1 前言

2.2 实验材料及仪器

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论：

2.5 本章小结

第3章小清蛋白单抗的制备及鉴定

3.1 前言

3.2 实验材料、试剂及仪器

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第4章金磁复合微粒与酶标抗原的制备

4.1 前言

4.2 实验材料及仪器

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5本章小结

第5章金磁酶联免疫法检测小清蛋白体系的建立

5.1 前言

5.2 实验材料、试剂及仪器

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

第6章结论与展望

参考文献

致谢

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