Gitelman综合征分子发病机制的研究及临床分析

摘要

Gitelman综合征是常染色体隐性遗传病（OMIM263800），是肾单位远曲小管重吸收NaCl障碍造成的原发肾性失盐性疾病，临床特征表现为正常或偏低的血压，肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活以及低氯性碱中毒、低血钾、低血镁和低尿钙。Gitelman综合征常是由位于染色体16q13的SLC12A3基因失活突变引起的，该基因编码噻嗪类利尿剂敏感的离子通道—钠、氯共同转运子（Na-Cl Cotransportor, NCCT）。目前已发现100余个SLC12A3基因突变位点可能与Gitelman综合征有关，包括错义突变、剪切突变、无义突变、读码框位移突变以及起始密码子突变等，其中复合杂合突变多于纯合子突变，无热点突变发现。Gitelman综合征在表型上与经典型Bartter综合征存在一定的重叠和交叉，少数SLC12A3突变的病人出现类似Bartter综合征的表型，也有少数表型类似Gitelman综合征的患者是由经典型Bartter综合征相关基因CLCNKB突变引起的。氯离子清除试验和基因诊断可帮助鉴别之。目前国内尚无Gitelman综合征致病基因的研究及较大组患者临床表型的分析。本课题重点研究中国Gitelman综合征患者SLC12A3基因突变特点并对其临床表型进行分析。 本研究第一部分选取2001-2006年本院住院诊断为Gitelman综合征或Bartter综合征的26例病人，其中男性16人，女性10人，平均年龄35±14岁，分别来自21个不同的家系，2例患者来自近亲结婚家系。其中一例患者进行了氯离子清除试验并观察对襻利尿剂和噻嗪类利尿剂的反应。该患者氯离子的清除率（CCl）为2.17ml/min,远端小管的重吸收率(DFC)为76.1％，应用呋噻米后CCl显著增加，DFC显著减少，而双氢克尿噻无明显效应。氯离子清除试验证实患者肾远曲小管存在重吸收功能障碍而髓襻升枝粗段重吸收功能正常，支持Gitelman综合征的诊断。在基因分析中，通过PCR扩增SLC12A3和CLCNKB基因所有编码区和两侧内含子边界，直接测序寻找突变位点。序列分析怀疑存在杂合缺失或插入突变时，PCR产物亚克隆于pGEM-Teasy质粒并扩增，采用质粒通用引物T7/SP6测序。RT-PCR验证剪切突变。我们共确定分布于SLC12A3基因19个突变位点。12个是新发现突变位点，其中包括7个错义突变：Gly196Val, Thr339Ile, Asn359Lys, Tyr386Cys，Cys430Gly, Gly439Val和Leu571Pro; 2个缺失突变：1384delG & 346-353delACTGATGG, 1个复合缺失+插入突变：492-496delTACGGinsA，一个非移码插入突变：997insCys和1个导致剪切突变的置换突变：Del n7426-n7438（GCGGACATTTTTG）& Ins(ACCGAAAATTTT) 。7个已报道过的突变，其中包括6个错义突变：Thr60Met, Cys421Phe, Asp486Asn, Arg655His, Arg913Gln & Arg928Cys；一个缺失突变：2883-2884delAG。26个病人中12个病人携带Thr60Met纯合或杂合突变, 其中来自2个家系的4例患者为纯合突变，来自7个家系的8例患者为杂合突变。所有患者无CLCNKB基因突变位点发现。 本研究第二部分分析了第一部分通过基因诊断确诊的26例Gitelman综合征患者的临床表型和病理生理特点。26人中，生长发育迟缓2例，成年后身材矮小2例。患者初次就诊的平均年龄为25±11岁。患者初次就诊主诉的常见症状为肌肉无力（21/26）或痉挛（13/26）。通过调查，患者就诊时最常见的症状依次是疲劳、肌肉无力、夜尿增多、嗜盐、烦渴、肌肉痉挛和心悸。但16例患者病程中首先出现的症状可能是夜尿和烦渴多饮，14例患者有入学年龄尿床史。实验室检查，26例患者全部有低血钾和碱性尿。25例患者存在低血镁（<0.65mmol/l），24例患者存在低尿钙（24小时尿钙/尿肌酐<0.1mmol/mmol）。6例患者蛋白尿大于150mg/24小时，平均为458±343mg/24小时（n=6）。3例患者肾小球滤过率低于正常，分别为73、64和37ml/min/1.73m2，其中2例患者来自近亲结婚家系。男性患者组的钾离子和氯离子排泄分数分别为（34.8±23.7）％和（2.36±1.69）％，女性分别为（17.0±4.2）％和（1.23±0.39）％，男女两组患者差别显著(P<0.05)。随访22例患者中，给予单纯替代治疗或联合安替舒通、消炎痛治疗后的血钾平均水平为2.91±0.33mmol/l，仅4例患者血钾水平达到正常（4/22）。 总之，通过本研究可得出如下结论：发现中国人群可能与Gitelman综合征相关的19个突变位点，其中12个新发现突变位点；通过对Gitelman综合征表型、基因突变特点和突变频率的分析证实Gitelman综合征并非罕见病；Thr60Met可能是亚洲人Gitelman综合征患者最常见的突变，是否为热点突变还需要更多病例的研究证实； Gitelman综合征通常认为发病于青春期或成年后，但实际发病年龄可能通常更早；低血镁和低尿钙并非Gitelman综合征的固定特征；Gitelman综合征是病情缓和、预后良好的疾病，但有致发育迟缓和进展至肾功能不全的危险，仍需积极治疗；Gitelman综合征有较大的遗传异质性，特异的表型和基因型之间的联系较难确定，基因诊断和氯离子清除试验是Gitelman综合征的诊断金标准。Gitelman综合征男性患者可能有较女性患者存在更严重的临床表型，性别差异解释了Gitelman综合征表型异质性的部分原因。