中国南海海绵可培养共生真菌种群多样性、抑菌活性的研究及PKS,NRPS功能基因的筛选

摘要

采用马丁氏培养基、MYPG培养基、查氏培养基、高氏一号培养基、2216E培养基和M1培养基共6种不同培养基，分别在20℃、25℃、30℃温度下对采集自中国南海的10种海绵共生真菌进行分离培养。并根据18S rDNA片段序列信息对分离到的真菌菌株进行了系统发育分析。采用了牛津杯法以大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黑曲霉(Aspergillus nigers)和白假丝酵母(Candida albicans)为指标菌，对分离到的菌株进行抑菌活性的筛选，并用PCR技术对分离到的177株真菌基因组进行了聚酮合酶（PKS）基因和非核糖体肽合成酶（NRPS）基因的筛选。
　　实验结果显示：采用6种培养基3个温度梯度的组合共分离得到177株真菌菌株，其中从X4海绵中分离到了8株真菌菌株，X5(23)、X6(32)、X7(1)、X8(4)、X9(35)、X10(22)、X11(17)、X12(25)、X13(10)。在20℃、25℃、30℃三个培养温度下分离到的真菌菌株数量没有明显差异，在所采用的6种培养基中，马丁氏培养基和MYPG培养基分离得到的菌株数最多，分别为46和44；其次是查氏和M1培养基，分别为32和24；高氏一号培养基和2216培养基再次之，分别为17和14。采用真菌18S rDNA特异引物PCR扩增，通过TaqI、HinfI、HaeIII三种限制性内切酶对PCR产物进行RFLP酶切分型，共得到24株独立菌。对24株菌的PCR产物测序并BLAST进行在线序列比对，从而得到这些菌株的生物学信息。24株菌的序列分析显示，所有分离出的真菌分别属于子囊菌门下Ascomycota4目(小囊菌目 Microascales、黑痣菌目Phyllachorales、肉座菌目 Hypocreales和散囊菌目 Eurotiales)10属。其中散囊菌目下的青霉属(Penicillium)和曲霉属(Aspergillus)（37.5％）；肉座菌目下的棒束孢属(Isaria)、拟青霉属(Simplicillium)等6个属（41.6%）是优势的真菌类群。
　　采用6种指标菌对分离得到的177株真菌菌株进行抑菌活性筛选，结果共有11株真菌表现出了抑菌活性，其中3株(x4-167、x11-75、x12-91)对枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)表现出抑菌活性，8株(x6-13、x10-49、x10-63、x12-94、x12-95、x12-109、x13-105、x13-118)对荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)表现出抑菌活性，其中x13-105, x12-94和x13-118同时对枯草芽孢杆菌(Bacillus sp.)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)表现出活性。
　　获得了15条790 bp的PKS基因片段, BLAST比对结果表明这些PKS基因片段与一株产黄青霉 Penicillium chrysogenum Wisconsin54-1255的基因组序列和一株致病烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293的PKS序列具有很高的相似性(98%-99%)。研究中筛选到的PKS基因均为 I型的PKS。同时,克隆到4条1200 bp的NRPS基因片段, BLAST比对结果表明4条 NRPS序列都与产黄青霉 Penicillium chrysogenum Wisconsin54-1255的基因组序列具有很高的相似性(98%-99%)。
　　本研究通过分子鉴定和系统发育的分析揭示南海海绵具有非常丰富多样的可培养真菌，是丰富的海洋微生物资源。相对于其它培养基，马丁氏培养基与MYPG培养基更适合海绵真菌的分离培养。不同的海绵体内真菌组成存在差异，海绵也存在富含真菌的海绵与寡真菌海绵之分。本研究揭示了青霉和曲霉属真菌在海绵中的广泛分布。作为海洋真菌活性产物中产生最多的来源，本研究分离得到的部分青霉和曲霉菌表现出了对细菌的广谱抑菌活性，从一些菌株中发现了PKS和NRPS基因的存在，暗示我们这些带有PKS和NRPS的真菌可能在海绵化学联合防御中起作用。在对真菌PKS和NRPS研究中我们发现，在同一菌株中存在多种PKS或NRPS基因，基于PKS和NRPS基因的多样性和新颖性，可以指导筛选具有药用价值的新化合物合成能力的活性菌。通过抑菌实验筛选到的部分菌株对革兰氏阴性细菌(P.fluorescens)表现出较强活性，研究结果对筛选具有药用价值的新化合物合成能力的海绵来源真菌具有很好的指导意义。本研究推测PKS/NRP在海绵共生活性菌与海绵的共生关系中起到帮助宿主防御外来侵害的作用，为海绵活性物质的微生物来源假说提供了证据。

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第一章 绪 论

前言

1.1海绵及海绵共生微生物

1.2海绵真菌

1.3 海绵功能基因

1.4 PKS简介

1.5 NRPS及研究现状

1.6 研究目的、内容与意义

第二章 中国南海海绵共生真菌的分离培养及系统发育分析

2.1实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 本章小结

第三章 可培养海绵共生真菌的抑菌活性筛选

3.1材料与方法

3.2结果与讨论

3.3本章小结

第四章 可培养海绵共附生真菌PKS，NRPS基因的筛选

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果与分析

4.4 本章小结

第五章 结 语

5.1 前景分析

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文