沙门氏菌血清分型分子靶点的发掘及鉴定体系的建立

摘要

沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，它引起的食物中毒病例在世界范围内常常排在首位。该菌有2500多个血清型，近50个血清组。但是，能够感染人类的致病菌株主要集中于4个血清组（即血清组A、B、C和D）中，其中伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡沙门氏菌等8种血清型是最常见的感染人体和禽畜类动物的菌型。传统的血清学分型方法存在着许多缺陷，不能及时、准确地鉴定菌株的血清型。PCR方法以快速、灵敏、准确等优点逐渐成为其重要的替代方法之一。
　　本研究通过生物信息学技术建立了靶点发掘平台，采用比较基因组的方法，分别发掘了沙门氏菌血清组A-D和上述8种常见血清型沙门氏菌的特异PCR检测靶点，并以此分别建立了血清组和血清型多重PCR检测体系，可鉴定A-D血清组及8种血清型的菌株。
　　沙门氏菌血清组A-D多重PCR检测体系的建立。分别从NCBI，Sanger研究院，美国伊利诺斯州大学和美国华盛顿大学基因组测序中心等基因组数据库下载到沙门氏菌已经测序菌株的全基因组序列，并按照沙门氏菌的血清组形式建立6个血清组的基因组库:A型，B型，C1型，C2型，D型和其他型。除其他型外，每个库中选择一株代表菌株，将其基因组序列依次切割成长度为986 bp的DNA片段，然后将这些片段与所有的沙门氏菌的基因组进行序列比对，选择出仅在代表菌株所属基因组库中存在的DNA片段，所得片段将作为PCR检测的候选靶点。血清组A、B、C1、C2和D分别发掘到2、6、7、10和7个特异序列。以这些特异序列为模板，分别设计引物，通过PCR方法分别选出每个血清组中特异性和灵敏度俱佳的引物对。将这5个血清组的引物对进行组合建立多重PCR体系。应用该体系对107株来自不同血清组的沙门氏菌分离株的进行检测，结果表明，本研究建立的PCR体系验证结果与Luk等建立的B、C2和D(A)血清组多重PCR体系以及血清学鉴定结果一致。检测食品样品时，只需增菌12h，就可从初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳样品中检测出阳性结果。
　　沙门氏菌8种常见血清型多重PCR检测体系的建立。按照类似的方式建立8个沙门氏菌血清型的基因组库:伤寒沙门氏菌/丙型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸡沙门氏菌以及其他血清型库。将每个血清型库中的代表菌株的基因型序列也切割成986 bp的DNA片段，与所有的沙门氏菌的基因组进行序列比对，选出每个血清型的候选靶点，分别有1、11、18、1、22、4和3个。经PCR筛选出各个血清型中特异性和灵敏度皆优的引物对，构建多重PCR体系。该体系可从153株分离株鉴定出肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等8种血清型，与血清学验证的结果一致;只需增菌12h，便可从初始接菌量在≤5 cfu/10mL的牛乳样品中检测出这8种血清型。
　　沙门氏菌血清组与血清型靶点基因的功能分析。沙门氏菌血清组的32个特异靶点中，含有34个基因，主要是rfb基因、膜蛋白基因和纤毛基因。这些基因主要与糖的合成与代谢、糖基的转移或者运输有关，对沙门氏菌血清组的0抗原的形成和保持稳定起着至关重要的作用，说明血清组间的差异与菌株的LPS的糖基有着密切关系。经基因功能分析，沙门氏菌的血清型特异靶点对应的基因主要是噬菌体基因、致病因子基因、转座子基因、限制性内切酶基因等。这些基因与移动元件和毒力基因密切相关，可使菌株对其宿主和环境产生适应性，可能是这些菌株为了更好的适应不同的宿主和环境而产生了相应的血清型。
　　沙门氏菌分离株的PCR分子检测与MLST分型。437株来自食品、养殖场和临床的沙门氏菌分离株，分别用建立的血清组和血清型鉴定体系进行分子血清分型。这些分离株被鉴定出A、B、C1、C2和D五个血清组，以及伤寒与副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、婴儿沙门氏菌、鸡沙门氏菌、肠炎沙门氏菌和阿贡纳沙门氏菌等血清型，与血清学鉴定结果相比，两者的Kappa值都处于0.80以上，说明结果基本一致。其中，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌占了40～50％，这两种血清型的菌株用MLST方法进行了亚分型分析，肠炎沙门氏菌的ST型较为单一，以ST11为主，是世界范围内极为普遍的菌型;鼠伤寒沙门氏菌的ST型有5种分型，其中临床和养殖场的分离株以ST19型为主，食品菌株则以ST34为主，还发现了3种只出现在东亚和东南亚范围的ST新型。根据菌株的耐药检测结果发现，鼠伤寒沙门氏菌的ST型与其耐药性有一定的相关性，其中ST34型菌株的耐药种类最多，通常可以对6～8种抗生素产生抗性。经进化分析，发现食品分离株与临床分离株具有十分紧密的联系。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1．1 沙门氏菌生物学特性

1．2 沙门氏菌与食品安全

1．3 沙门氏菌流行病学特征

1．4 沙门氏菌的分型

1．4．1 沙门氏菌的血清分型

1．4．2 沙门氏菌的噬菌体分型

1．4．3 沙门氏菌的分子分型

1．5 沙门氏菌的血清鉴定研究进展

1．6 沙门氏菌的基因组测序

1．7 几种常见血清型的介绍

1．8 研究的意义、目的及思路

1．8．1 研究目的和意义

1．8．2 研究思路

第二章 血清组A-D分子靶点的发掘及多重PCR体系的建立

2．1 材料

2．1．1 运行软件

2．1．2 BLAST软件的下载及安装

2．1．3 菌株

2．1．4 培养基

2．1．5 主要试剂及配制

2．1．6 仪器与设备

2．2 方法

2．2．1 全基因组数据的下载和本地数据库的建立

2．2．2 血清组A、B、C和D代表菌株的选择

2．2．3 全基因组序列切割方式的选择

2．2．4 血清组特异候选靶点的发掘

2．2．5 候选靶点特异性的在线验证

2．2．6 沙门氏菌菌株的血清组鉴定

2．2．7 DNA提取及纯度分析

2．2．8 引物设计

2．2．9 PCR反应体系及循环参数

2．2．10 引物评价

2．2．11 血清组多重PCR体系的建立

2．2．12 血清组多重PCR体系的特异性评价

2．2．13 血清组多重PCR体系的灵敏度评价

2．2．14 人工污染食品样品检测

2．3 结果

2．3．1 全基因组数据的下载和本地数据库的建立

2．3．2 血清组A、B、C1、C2和D代表菌株的选择结果

2．3．3 全基因组序列的切割结果

2．3．4 血清组特异候选靶点的发掘

2．3．5 候选靶点特异性的在线验证

2．3．6 沙门氏菌菌株的血清型鉴定

2．3．7 引物设计及其评价

2．3．8 血清组多重PCR体系的建立

2．3．9 血清组多重PCR体系的特异性和灵敏度评价

2．3．10 人工污染食品样品检测

2．4 讨论

2．4．1 沙门氏菌血清组靶点发掘中筛选方式的选取及优缺点评析

2．4．2 沙门氏菌血清组靶点发掘中DNA片段切割程序的不足与改进

2．4．3 沙门氏菌血清组多重PCR靶点与引物的选取及检测体系的评价与分析

第三章 8种常见血清型分子靶点的发掘及PCR体系的建立

3．1 材料与方法

3．1．1 运行软件及安装

3．1．2 培养基、试剂及仪器设备

3．1．3 血清型沙门氏菌的本地数据库的建立

3．1．4 常见沙门氏菌血清型及其代表菌株的选择

3．1．5 全基因组序列的切割

3．1．6 特异候选靶点的发掘

3．1．7 候选靶点特异性的在线验证

3．1．8 菌株

3．1．9 沙门氏菌菌株的培养

3．1．10 沙门氏菌分离菌株的血清型鉴定

3．1．11 DNA提取及纯度分析

3．1．12 沙门氏菌菌株DNA模板的PCR检测

3．1．13 引物设计

3．1．14 引物评价

3．1．15 血清型多重PCR体系的建立

3．1．16 血清型多重PCR体系的特异性评价

3．1．17 人工污染食品样品检测

3．2 结果

3．2．1 本地数据库的建立

3．2．2 血清型代表菌株的选择结果

3．2．3 全基因组序列的切割与靶点发掘结果

3．2．4 候选靶点特异性的在线验证

3．2．5 沙门氏菌菌株的血清型鉴定

3．2．6 引物设计及特异性、灵敏度评价

3．2．7 血清型多重PCR体系的建立

3．2．8 血清型多重PCR体系的特异性评价

3．2．9 人工污染食品样品检测

3．3 讨论

3．3．1 沙门氏菌血清型靶点发掘评析

3．3．2 与文献报道的沙门氏菌血清型靶点发掘方法的对比分析

3．3．3 沙门氏菌血清型多重PCR引物的选取与分析

第四章 血清组与血清型分子靶点的功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 蛋白分析软件

4．1．2 靶点的蛋白序列分析

4．1．3 蛋白结构预测与功能分析

4．1．4 基因与表型相关性分析

4．2 结果

4．2．1 血清组靶点基因功能分析结果

4．2．2 血清型靶点基因功能分析结果

4．3 讨论

4．3．1 血清组靶点基因与各个血清组间的表型差异的相关性分析

4．3．2 血清组C1的靶点基因SCH_0368和SCH_0595的进化分析

4．3．3 血清型靶点基因与各个血清型问的表型差异的相关性分析

4．4 小结

第五章 沙门氏菌分离株的分子检测与分型

5．1 材料

5．1．1 菌株

5．1．2 试剂与仪器

5．2 方法

5．2．1 多重PCR检测分离株

5．2．2 血清学鉴定分离株

5．2．3 耐药性测试验

5．2．4 MLST分型

5．2．5．数据分析

5．3 结果

5．3．1 分离株鉴定结果

5．3．2 MLST结果

5．3．3 流行病学分析

5．4 讨论

第六章 总结与展望

6．1 主要结论

6．2 创新性

6．3 展望

参考文献

致谢

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