SIRT1和SIRT6及相关分子在机械应力对血管细胞功能调控中的作用

摘要

血管重建（remodeling）是很多心血管疾病共同的发病基础和基本病理过程，机械应力在其中起重要调控作用。体内血管主要受到切应力(shear stress)和周期性周向张应变（circumferential strain）等血流动力学因素的作用。内皮细胞（endothelial cells，ECs）和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的主要细胞成分，ECs直接受到切应力的作用，而VSMCs主要承载周期性张应变的作用。在力学因素的作用下，血管重建的力学生物学（mechanobiology）机制尚需进一步阐明。Sirtuin蛋白是一系列NAD+依赖的去乙酰化酶家族，它们在与衰老相关的疾病，还有心血管系统疾病、Ⅱ型糖尿病和癌症等其它疾病中发挥重要作用。但是，sirtuin蛋白是否参与力学因素对血管细胞功能的调控，目前还鲜有报道。
　　本文第一部分，应用平行平板流动腔系统对单独培养的ECs和与VSMCs联合培养的ECs施加正常切应力（15 dyn/cm2），观察切应力对ECs增殖的影响。应用蛋白免疫印迹、流式细胞术、免疫荧光和RNA干扰等技术方法，研究SIRT1和缝隙连接蛋白（connexin，Cx）在其中的作用及其机制。结果显示，在单独培养条件和联合培养条件下，正常切应力均抑制ECs增殖、激活ECs的SIRT1表达，而抑制Cx40表达。SIRT1抑制剂salermide和干扰SIRT1均逆转切应力对ECs增殖的抑制，导致ECs增殖上调，Cx40表达降低。SIRT1激活剂白藜芦醇（resveratrol）可激活静态条件下联合培养ECs的SIRT1表达，从而促进ECs增殖，降低 Cx40表达。结果表明，正常切应力可抑制 ECs增殖。SIRT1和Cx40存在相互调控关系，它们共同参与了正常切应力对ECs增殖的抑制作用。
　　本文第二部分，应用FX-4000T细胞张应变加载系统对VSMCs施加周期性张应变(加载幅度为10％、频率为1.25 Hz)，观察正常张应变对VSMCs分化的影响。除了应用上述第一部分方法外，还用酶联免疫吸附试验，观察VSMCs的TGF-β1分泌情况，着重探讨SIRT6、c-fos/c-jun和ICAM-1信号通路在其中的作用。结果显示，周期性张应变促进了VSMCs向收缩表型分化，促进VSMCs分泌TGF-β1，使Smad2和Smad5磷酸化水平升高，并激活SIRT6、c-fos和ICAM-1。TGF-β1重组蛋白刺激静态条件下的VSMCs，也能激活SIRT6。TGF-β1封闭性抗体能够拮抗张应变对SIRT6的激活作用。SIRT6干扰后，抑制了周期性张应变引起的VSMCs分化，抑制了Smad4、c-fos和ICAM-1的表达，但未影响TGF-β1的分泌，并且对Smad2和Smad5的磷酸化水平也无影响。结果表明，正常周期性张应变促进 VSMCs向收缩表型分化，TGF-β1/SIRT6/c-fos和ICAM-1信号通路在此过程中起重要作用。
　　综上所述，生理条件下的切应力和周期性张应变分别抑制 ECs增殖，促进 VSMCs向收缩表型分化，维持血管壁结构和功能的稳定。Sirtuin蛋白及其相关分子Cx40、TGF-β1/SIRT6/c-fos和ICAM-1在其中起到重要作用。这些新结果对阐明血管重建的力学生物学机制有重要意义。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词

第1章 SIRT1在切应力调控联合培养的内皮细胞增殖中的作用

1.1 引言

1.2 实验材料和方法

1.3 实验结果

1.4讨论

1.5 小结

第2章 SIRT6在周期性张应变调控血管平滑肌细胞分化中的作用

2.1 引言

2.2 实验材料和方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

全文结论

文献综述: Sirtuin蛋白家族的研究进展

1 引言

2 Sirtuin蛋白家族研究历史

3 哺乳动物sirtuin蛋白分类及细胞定位

4 SIRT1的研究现状

5 SIRT6的研究现状

6 问题及展望

参考文献

附录1 实验仪器

附录2 主要溶液成分及配制

附录3 试剂

致谢

攻读博士学位期间已发表的学术论文

答辩决议书