核壳柱液相色谱-蒸发光散射检测联用及其在20种氨基酸检测中的应用

摘要

氨基酸是生命体基本物质之一，也是常见的饲料添加剂、食品添加剂和药物制剂成分。对于氨基酸分析目前存在样品处理需进行衍生化、衍生物不稳定、运行费用高、仪器昂贵、反应条件冲突、操作时间长等问题。蒸发光散射检测器是一种质量检测器，其检测原理为依靠物质的挥发性不同而进行检测，与物质本身结构没有关系，适用于食品安全、药物分析、中药成分分析等领域。而Halo核壳色谱柱由于具有2.7μm的核壳多孔填料，能达到1.6μm填料的分离度的同时还具有在普通液相色谱仪器上适用的柱压，大大提高复杂产物的分离度。基于上述背景，我们以蒸发光散射检测器（ELSD）、“HALO”核-壳型新型填料液相色谱柱联用，初步构建了一种高效液相色谱—蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）直接测定20种未衍生氨基酸的分析方法，并将其用于复方氨基酸注射液中氨基酸含量的测定。该方法快速、准确、稳定、灵敏，对混合氨基酸进行了有效的分离。
　　本论文总共分为五章，分别包括以下主要内容：
　　第一章介绍选题背景和意义。一介绍了氨基酸的种类和应用，核壳色谱柱的简介和蒸发光散射检测器的原理，综述了氨基酸分析方法和研究进展。
　　第二章主要采用HILIC色谱柱、新型色谱柱HALO柱、常规普通C18色谱柱、和HALO Amide柱对氨基酸的分离进行了初步的筛选，发现普通C18色谱柱上要实现氨基酸的基线分离，运行时间至少要40分钟左右；HILIC柱内径为1.0 mm，实验中明显发现该柱的柱容量和分离能力都相对较差，经过流动相种类和梯度的调整，明显没有HALO柱的分离效果好；极性嵌入基团的HALO Amide柱对前6种亲水性较强氨基酸的分离并未能起到明显的提高作用，同时因为柱子整体含碳量的降低，反而使得整体分离的情况稍有变差。对色谱柱柱长的调整，在梯度不变运行时间不变的情况下，氨基酸的保留明显15 cm柱会更好些，柱长增加，系统压力仍在仪器耐压范围内。综合以上对比，15 cm的HALO C18色谱柱可以达到氨基酸的分离要求。
　　第三章主要构建核壳柱液相色谱-蒸发光散射检测20种未衍生氨基酸方法的开发。通过对流动相中有机相种类、水相中三氟乙酸、七氟丁酸、九氟戊酸浓度、流速、柱温等条件进行优化，同时进行了蒸发光散射检测器参数的优化，最终确定了采用HALO C18柱（2.7μm，4.6 mm I.D.×15 cm），以甲醇-九氟戊酸-七氟丁酸-三氟乙酸-水为流动相进行梯度洗脱，流速0.5 ml/min，ELSD飘移管温度40℃，载气流速3.0 L/min，对20种未衍生氨基酸进行分离检测。
　　第四章主要对筛选的色谱方法进行了分析方法验证。结果氨基酸的质量浓度在0.01～1.0 mg/ml范围内，其峰面积的对数值与进样质量的对数值呈良好的线性关系；氨基酸的检出限介于20～50 ng之间，样品加标回收率为89.0％～111.2％。连续进6针，各氨基酸的精密度均符合要求。不同仪器、不同批号色谱柱进行系统实用性实验，均符合要求。该方法可直接进行样品检测，无需样品衍生化处理，简单、快捷。
　　第五章总结了本论文主要的三部分实验的研究成果，提出了进一步实验及未来的展望。

目录

声明

符号说明

第一章 前 言

1.1氨基酸的种类和应用

1.2 核壳色谱柱简介

1.3 蒸发光散射检测器简介

1.4 本研究的目的和意义

第二章 直接检测未衍生氨基酸的色谱柱筛选

2.1研究背景

2.2 实验部分

2.3结果与讨论

2.4本章小结

第三章 构建核壳液相色谱-蒸发光散射检测器联用检测未衍生氨基酸分析方法开发

3.1研究背景

3.2 实验部分

3.3结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 构建核壳液相色谱-蒸发光散射检测器联用检测未衍生氨基酸分析方法验证

4.1研究背景

4.2 实验部分

4.3结果与讨论

4.4本章小结

第五章 总结与展望

5.1本文工作回顾

5.2推广应用前景

5.3面临的问题和相关建议

参考文献

致谢

作者攻读学位期间发表的论文