青蒿水杨酸生物合成途径关键酶基因的克隆及功能分析

摘要

青蒿素是一种含有过氧基团的倍半萜内酯化合物，是目前世界上最有效的疟疾治疗药物。文章综述了青蒿素生物合成基本途径，青蒿素生物合成途径的关键酶以及青蒿素生物合成分子调控。水杨酸（Salicylic acid，SA）是重要的植物激素，在植物的生长发育上起了非常重要的作用，并与植物的抗病防御密切相关。异分支酸合成酶（Isochorismate synthase，ICS）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）是植物水杨酸合成途径的两个关键酶，分别负责将分支酸和苯丙氨酸转化为异分支酸和反式肉桂酸，然后进一步合成最终产物水杨酸。
　　前人已有研究，水杨酸处理青蒿能提高青蒿素的含量。本研究利用青蒿转录组数据，对青蒿AaICS1和AaPAL1基因进行了克隆和序列分析，通过RT-qPCR检测各基因的表达模式。通过相关基因的过表达、RNAi转基因株系，进一步分析青蒿AaICS1和AaPAL1基因在水杨酸合成中的作用。希望通过提高青蒿内源水杨酸含量，从而提高转基因青蒿中青蒿素的含量。研究取得的结果如下：
　　1.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的克隆与分析。
　　利用拟南芥基因序列和青蒿转录组数据，设计引物克隆AaICS1（GenBank登录号为KP100111）和 AaPAL1（GenBank登录号为KP256149）。AaICS1开放阅读框1710 bp，编码570个氨基酸，多重序列对比表明AaICS1翻译的氨基酸序列与其他的ICS翻译的氨基酸序列具有较高的相似性。AaPAL1开放阅读框2151 bp，编码716氨基酸，多重对比表明AaPAL1翻译的氨基酸序列与其他PAL翻译的氨基酸序列具有较高的相似性。Southern杂交用于分析AaICS1和AaPAL1基因的拷贝数。结果表明，AaICS1基因在青蒿中为单拷贝，AaPAL1在青蒿中可能为三拷贝。
　　2.青蒿AaICS1和AaPAL1启动子的克隆与分析。
　　利用克隆到的基因序列和青蒿基因组的数据，设计引物克隆AaICS1和AaPAL1的启动子，并对启动子的顺式作用元件进行预测。
　　3.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的表达分析。
　　RT-qPCR结果显示，AaICS1和AaPAL1在各个组织均有表达，但表达量存在差异，AaICS1在老叶中表达最高，在根中表达最低。AaPAL1在幼叶中表达最高，在根中表达最低。对青蒿进行不同胁迫处理，结果表明：AaICS1和AaPAL1基因能够响应伤害、干旱、盐胁迫和水杨酸处理，处理后基因表达量显著提高，这也和启动子作用元件的预测相符。
　　4.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的原核表达。
　　构建AaICS1和AaPAL1的原核表达载体pET-30a-AaICS1和pET-32a-PAL1，并在BL21大肠杆菌中表达，得到与预测大小一致的原核表达蛋白。
　　5.青蒿AaICS1和AaPAL1基因的过表达和干扰的遗传转化。
　　ICS和PAL是植物水杨酸合成途径中最关键的两个酶。为了验证水杨酸生物合成途径能使其诱导的次生代谢产物的含量增加，从而提高青蒿素的含量。对青蒿AaICS1和AaPAL1分别进行过表达和基因干扰，获得转基因植株，RT-qPCR结果显示过表达转基因青蒿植株中相应基因表达量提高，而干扰的转基因植株相应基因表达量降低。HPLC分析结果显示过表达的转基因青蒿植株中青蒿素含量最高为对照组的1.5倍。

目录

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缩略词表

第一章 绪论

1.1青蒿及青蒿素简介

1.2青蒿素生物合成分子调控研究进展

1.3水杨酸及其生物合成途径

1.4技术路线

1.5小结与展望

第二章 不同诱导对水杨酸关键合成酶基因的影响研究

2.1引言

2.2材料与方法

2.3结果分析和讨论

2.4本章小结

第三章 青蒿水杨酸生物合成途径基因及启动子的克隆与分析

3.1引言

3.2材料

3.3实验方法

3.4结果与分析

3.5本章小结

第四章 青蒿水杨酸生物合成途径关键基因过表达与干扰分析

4.1引言

4.2材料与试剂

4.3试验方法与步骤

4.4试验结果分析

4.5本章小结

第五章 结论与展望

5.1总结

5.2本研究的创新点

5.3展望

参考文献

附录

致谢

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