3-氯丙醇脂肪酸酯的合成、毒效关系及肾毒机理

摘要

近年来，面包、咖啡、煎炸食品、熏制、腌制食品和精炼油，甚至婴幼儿奶粉和母乳中均检出了3氯-1，2-丙二醇（3-MCPD）酯，即3-MCPD与长链脂肪酸形成的酯类，引起人们的广泛关注。由于3-MCPD酯可以水解成3-MCPD，因此3-MCPD酯有潜在的肾毒性、生殖毒性、免疫毒性及致癌性。然而，至今为止，关于3-MCPD酯的毒理学研究还较少，其毒性机制尚不明确，因此本文旨在合成不同脂肪酸取代的3-MCPD酯，研究3-MCPD酯的结构和毒性的关系，及探究JNK和p53介导的细胞凋亡在3-MCPD酯引起的肾毒性过程中发挥的作用。
　　本研究中合成了7种3-MCPD酯，并采用液质联用技术、红外光谱和核磁共振波谱法表征其结构和纯度。采用Swiss小鼠，建立急性动物模型评价3-MCPD酯的急性毒性，同时还研究了3-MCPD酯对大鼠肾细胞 NRK-52E的细胞毒性。结果表明，3-MCPD1-棕榈酸、1-硬脂酸、1-油酸、1-亚油酸单酯的半数致死剂量分别为2676.81,2973.8,2081.4和2033.1 mg/kg体重。1-亚油酸-2-棕榈酸、1-棕榈酸-2-亚油酸和1，2-二棕榈酸二酯的半数致死剂量分别为5000,>5000和>5000 mg/kg体重。病理切片结果表明3-MCPD酯特异性损伤的器官主要为肾脏和睾丸，而且本研究还揭示3-MCPD酯特异性损伤胸腺、肺和脑。此外，本论文还对染毒小鼠血清尿素氮和肌酐水平进行了测定。同时，MTT和LDH结果表明只有3-MCPD单酯显著降低大鼠肾细胞NRK-52E的活力，且呈剂量相关性。
　　随后，选取3-MCPD棕榈酸单酯为代表，采用Sprague-Dawley大鼠为动物模型研究其肾损伤的生物学机制。采集染毒24小时后大鼠肾脏用于mRNA基因芯片分析。基因富集分类方法和KEGG通路分析软件对基因芯片结果分析发现3-MCPD棕榈酸单酯靶向调控丝裂原激活蛋白酶（MAPK）JNK、ERK，p53和凋亡信号通路相关基因的表达，而且实时荧光定量PCR、western blot和免疫组织化学结果与基因芯片数据一致。此外，组织病理学和 TUNEL结果进一步证明3-MCPD棕榈酸单酯可引起Sprague-Dawley大鼠肾小管细胞的凋亡。随后，采用p53基因敲除鼠研究p53调控3-MCPD棕榈酸单酯引起的肾毒性的靶向作用。与野生型C57BL/6小鼠相比，3-MCPD棕榈酸单酯给药后24小时，p53敲除鼠的肾小管细胞凋亡程度显著减轻，而且肾脏内凋亡相关蛋白 bax和 cleaved caspase-3的表达量显著降低。JNK抑制剂SP600125完全阻断了3-MCPD棕榈酸单酯引起的肾小管细胞凋亡，但是ERK抑制剂U0126对3-MCPD棕榈酸单酯引起的肾小管细胞的凋亡没有影响，说明JNK/p53靶向调节3-MCPD酯引起的肾小管细胞凋亡。
　　最后，本研究采用大鼠肾细胞 NRK-52E为模型，体外验证 JNK/p53的靶向调控作用。300μM棕榈酸单酯作用24小时后，细胞内凋亡相关蛋白 bax和 cleaved caspase-3表达量上调，bcl-2的表达量被抑制。同时，p53和JNK均被激活。此外，采用shRNA沉默 p53的表达后，3-MCPD棕榈酸单酯不能激活 bax和 caspase-3。JNK三个亚型JNK1、JNK2和JNK3的shRNA中，只有JNK1的shRNA显著降低棕榈酸单酯引起的肾细胞的凋亡，表现为 p-c-Jun、p53、p-p53、bax和 cleaved caspase-3表达量显著降低。说明JNK1/p53靶向介导3-MCPD酯引起的NRK-52E肾细胞的凋亡。
　　综上所述，急性毒性实验结果表明脂肪酸的不饱和程度、碳链长度、取代个数和相对的取代位置可能会影响3-MCPD酯的毒性。此外，本研究揭示了3-MCPD酯引起的肾毒性的生物学机制为JNK1/p53靶向调控的肾小管细胞凋亡。

目录

符号说明

第一章 绪论

1. 3-MCPD酯污染物在食品中的存在现状

2. 3-MCPD酯的有机合成

3. 游离3-MCPD的限量标准和毒理学研究

4. 3-MCPD酯的毒理学研究进展

5. 肾毒物引起的细胞凋亡及相关信号转导通路

6. 研究目的和内容

第二章 3-MCPD酯的合成，结构表征和纯度鉴定

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第三章 3-MCPD酯的结构和急性毒性关系的研究

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第四章 3-MCPD酯肾毒性的机制（体内研究）

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第五章 3-MCPD酯的肾毒性机制（体外研究）

1. 前言

2. 材料与方法

3. 结果

4. 讨论

第六章 结论和展望

1. 研究总结

2. 创新点

3. 展望

参考文献

附录

附录1：3-MCPD酯的红外、核磁共振和质谱图傅里叶红外谱图

附录2：p53-/-小鼠基因型鉴定

攻读博士学位期间已发表的论文

致谢