产酯酶海洋细菌的选育与菌株EB-2的发酵条件及酶学性质研究

摘要

微生物酯酶作为重要的工业用酶，广泛地应用于食品、化工、医药、环保及军事等领域。本论文对产酯酶海洋细菌进行了筛选和鉴定，复合诱变选育，产酶发酵条件以及酶学性质的研究。 根据酯酶的基本作用特性和机理，在初筛和复筛中添加适当的底物和指示剂，对产酯酶海洋细菌进行大量的筛选试验，同时建立了一种简便有效的筛选模型，并从中筛选出一株产酯酶菌株EB．1，产酶活力达22.8 U/mL。 通过对菌株EB-1的形态特征、培养特征、生理生化特征以及16S rRNA分子分类鉴定相结合的方法，最终将该菌株鉴定为Bacillus subtilis var．niger：菌体大小约为(0.6～0.7)岬×(1.5～2.5)lun；革兰氏染色阳性菌；呈杆状，圆端，单个或短链状排列；14 h后有单芽孢生成，不使菌体明显膨大；菌落初期为乳白色，表面光滑、粘稠；24 h后呈乳黄色，表面干燥；48 h后随时间的延长有大量的黑色素产生等。菌株EB-1的各项生理生化特征基本与陆源Bacillussubtilis相同，但也有一些其特有的性质，如能同化甘油、耐中盐以及能在0℃生长等。 为了使菌株EB-1适应发酵生产的需求，对其进行了原生质体紫外线复合诱变。在原生质体形成和再生的最佳条件下制备到的原生质体，经过紫外线诱变后，对再生突变菌株进行大量筛选，最终获得产酶稳定的菌株EB-2，其产酶活力达到77.6 U/mL，比出发菌株提高3.4倍，从而解决了该菌株规模化生产上的局限性。 另外，为了更好地提高产酯酶菌株EB-2发酵产酶水平，本文对其发酵条件进行了研究。通过单因子和正交试验对碳源、氮源、无机盐、诱导剂、培养时间、起始pH值、接种量和接种龄等发酵条件的研究，最终确定了菌株EB-2的最佳发酵培养基为：蔗糖15.0g/L、蛋白胨100L、牛肉膏7.5 g/L、K2HP04 0.5 g/L和花生油5.0 mL/L，此时的产酶水平达到了815.40 U/mL，比起始条件提高10.5倍；最佳产酶条件为：以种龄16 h、6％的接种量、10％的装液量装入250mL三角瓶中，35℃、220 r/rain培养22 h，最终使菌株的产酶水平达到了970.33 UmL，总体提高12.5倍。 对初步纯化到的酯酶的酶学性质进行了研究，其最适pH为10.0，最适温度为60℃，pH稳定范围为8.0～11.0，热稳定范围为35℃～60℃；经过SDS．PAGE凝胶电泳和Rotofor Cell等电聚焦仪分别测得其分子量为30.0 kDa、pI为4.5；金属离子中Ca2+、Mg2+、Li+、Zn2+为酯酶的激活剂，Ba2+、Fe3+、Ag+、Sr2+为其抑制剂；酸根离子中Br-、NO3-、PO43-。等可以增大酯酶活性；与常见化学试剂的配伍性较差，受到EDTA的抑制作用严重；在有机溶剂中，受到丙酮、乙醚、石油醚的激活，但是受到正己烷、异辛烷、氯仿的抑制；其最适底物为α-乙酸萘酯，其次为硝基苯磷酸二钠盐和三丁酸甘油酯。该酯酶是一种新型的碱性耐热酯酶，具有较高的耐碱性和热稳定性，为其工业化生产提供了便捷，同时也拓展了其在各个领域的应用范围。本论文的实验结果具有一定的创新性，填补了国内在微生物酯酶研究领域的一些空白，对加速开发我国海洋微生物资源的利用及其产业化具有重要的理论和实际意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章文献综述

1酯酶的分类与作用机制

1.1酯酶的标准分类法

1.2酯酶的aldridge分类法

1.3酯酶的特异性分类法

1.4酯酶的来源分类法

2酯酶的特性

2.1酯酶与脂肪酶的差异

2.2酯酶的催化特性

3酯酶酶活的测定方法

3.1平板检测法

3.2氢氧化钠滴定法

3.3乙酸萘酯检测法

3.4对硝基苯酚检测法

4微生物酯酶研究进展

4.1产酯酶微生物的类群

4.2产酯酶微生物的菌种选育概况

4.3微生物酯酶的发酵培养条件研究

4.4微生物酯酶的发酵产酶工艺研究

4.5微生物酯酶的研究发展趋势

5微生物酯酶的应用研究进展

5.1微生物酯酶在食品工业领域中的应用

5.2微生物酯酶在日用化工领域中的应用

5.3微生物酯酶在医药工业领域中的应用

5.4微生物酯酶在环保及军事中的应用

6海洋微生物资源的开发和利用

第二章产酯酶海洋细菌的筛选与鉴定

1材料与方法

1.1试剂及主要仪器

1.2样品

1.3培养基

1.4实验方法

2结果与分析

2.1测定α-萘酚的标准曲线

2.2产酯酶菌株筛选结果

2.3常规分类鉴定结果

2.4分子分类鉴定结果

3讨论

第三章酯酶高产菌株的复合诱变与选育

1材料与方法

1.1菌种

1.2培养基及试剂

1.3原生质体诱变育种

1.4筛选方法

2结果与分析

2.1菌株生长曲线

2.2原生质体制备与再生的各种影响因素

2.3紫外线复合诱变原生质体

3讨论

第四章酯酶高产菌株EB-2发酵条件的研究

1材料与方法

1.1菌种

1.2培养基

1.3发酵试验

1.4产酶培养基的优化

1.5酯酶酶活力的测定

2结果与分析

2.1产酶发酵培养基的影响

2.2产酶培养条件的影响

2.3不同酯酶生产菌株培养条件的比较

2.4菌株EB-2胞内胞外酯酶的比较

3讨论

第五章酯酶BSE-1酶学性质的初步研究

1材料与方法

1.1实验试剂

1.2实验仪器

1.3实验方法

2结果与分析

2.1牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线

2.2酯酶分子量的测定

2.3酯酶等电点的测定

2.4酯酶最适pH及最适温度的测定

2.5酯酶pH稳定性及热稳定性研究

2.6金属离子及酸根离子对酯酶酶活的影响

2.7化学试剂对酯酶酶活的影响

2.8酯酶在有机溶剂中的稳定性研究

2.9酯酶的底物特异性

2.10不同来源的酯酶部分性质的比较

3讨论

结论

参考文献

附录

致谢