不同脆化阶段草鱼免疫机能的变化与调控

摘要

普通草鱼(Ctenopharyngodon idellus)摄食单一饵料蚕豆(Vicia faba)120 d后，可成为风味独特的脆肉鲩，目前已成为广东省中山市东升镇的特色产业，且消费范围也由广东逐渐覆盖至全国。但是，在脆肉鲩养殖生产过程中常出现的“半脆”、“过脆”和“肿身病”死亡的现象，曾一度难倒众多养殖户，至今对草鱼脆化时的生理病理变化过程仍不清楚。为此，本文首先进行肌肉脆化特性分析，再从肠道菌群组成与血清免疫酶活性、头肾与肝脏的超微结构、溶菌酶等免疫基因的定量表达3个方面，综合探讨草鱼在不同脆化阶段的生理生化状况，以期阐明脆肉鲩的免疫健康状态，进而为脆肉鲩的健康养殖提供科学的指导资料。具体研究内容如下：
　　1.本研究首先检测草鱼肌肉脆化效果，为后续脆肉鲩免疫机能的研究做准备。结果显示，脆化120 d时，蚕豆组草鱼肌纤维直径比对照组减少了28.12％(P<0.01)，肌纤维密度增加了99.14%(P<0.01)。脆化120 d时，蚕豆组草鱼肌肉硬度、弹性、咀嚼性、内聚性和胶黏性分别比对照组增加了39.76%(P<0.01)、37.20%(P<0.01)、92.82%(P<0.01)、30.43%(P<0.01)和68.17%(P<0.01)。实验结果发现，不同时期摄食蚕豆的草鱼肌纤维直径逐渐减小、肌纤维密度逐渐增大、肌肉硬度与弹性等逐渐增大，表明已获得不同脆化程度的脆肉鲩。
　　2.检测不同脆化阶段草鱼肠道菌群组成结构、血清酶活性及生长性能，进而衡量脆肉鲩形成过程中的生理生化变化。结果显示，60~150 d蚕豆组草鱼体重均低于对照组，90~120 d蚕豆组草鱼头肾体指数和肝体指数均低于对照组，150 d时蚕豆组草鱼肝体指数与对照组无显著差异；蚕豆组草鱼血清碱性磷酸酶、溶菌酶和补体C3(第30天除外)活性均低于对照组的，在转投喂饲料后，3种血清酶活性均出现回升趋势；与对照组相比，蚕豆组草鱼肠道菌群多样性降低，芽胞杆菌属(Bacillus)和鲸杆菌属(Cetobacterium)等有益菌数量减少，维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等条件致病菌数量增多。两组草鱼肠道核心菌群主要为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)。本研究结果表明，随着脆化时间的增加，饲喂蚕豆改变草鱼肠道菌群组成、抑制血清酶活性和生长性能，在脆化120 d转投饲料后(蚕豆组第150 d时)其肠道菌群、血清酶活性及生长性能均有所改善。
　　3.为了探究投喂蚕豆对草鱼免疫相关组织结构的影响，本研究还观察了不同脆化阶段草鱼头肾、肝脏和肠道的超微结构变化。超微结构分析结果显示，蚕豆组草鱼头肾细胞出现空泡；脆化后期头肾细胞受损，出现组织坏死区域。蚕豆组草鱼肝脏细胞逐渐肿大，线粒体和内质网数量逐渐减少，并杂乱的分布在细胞质中，窦周隙出现不同程度的损伤，表现为肝细胞微绒毛和内皮细胞损坏或缺失；脆化后期，肝细胞核形状异常，血窦形态结构紊乱。蚕豆组草鱼肠道粘膜上皮出现炎症，表现为微绒毛逐渐稀疏、变短，受到损伤；脆化后期粘膜上皮部分区域微绒毛消失，细胞间紧密连接暴露，上皮细胞表面遭到损坏。本研究结果表明，投喂蚕豆对草鱼头肾、肝脏和肠道组织结构的影响是一个逐渐变化的过程，随着脆化时间的延长，免疫相关组织结构的损坏越严重。
　　4.最后，本实验在基因水平定量检测了投喂蚕豆对草鱼头肾和肝脏组织中C型溶菌酶(C-type lysozyme)、白介素1β(IL-1β)、干扰素I型(IFN-I)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、免疫球蛋白M(IgM)和主要组织相容性复合体I(MHC-I)6种免疫基因表达的影响。结果显示，蚕豆组草鱼头肾中 C-type lysozyme、IFN-I、IgM和MHC-I的表达、肝脏中IFN-I、TNF-α、IgM和MHC-I的表达在草鱼摄食蚕豆期间显著下调；在转投饲料30 d后(蚕豆组第150 d时)，除蚕豆组草鱼头肾C-type lysozyme外，上述蚕豆组草鱼基因的表达皆呈现回升趋势。本研究结果表明，投喂蚕豆对草鱼头肾和肝脏组织中免疫基因的表达产生了一定的抑制作用，转投饲料30 d后(蚕豆组第150 d时)可以使受到抑制的免疫基因的表达有所恢复。
　　总之，脆化120 d的草鱼，继续摄食30 d的人工配合饲料，其肌肉脆化效果并未受到影响。投喂蚕豆后，草鱼肠道菌群多样性及有益菌数量减少、血清免疫酶活性受到抑制、免疫相关组织超微结构损伤、免疫基因的表达受到抑制，而脆化结束时转投人工配合饲料30 d后，脆肉鲩的免疫机能有所改善。本论文研究结果为脆肉鲩规模化集约养殖和降低长途运输中脆肉鲩的应激反应提供了科学指导资料和理论依据。

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引言

1 蚕豆的营养价值

2 蚕豆作为鱼类饲料的应用研究

3 蚕豆投喂草鱼形成特色水产品脆肉鲩

4 本论文研究目的与意义

第一章 不同脆化阶段草鱼肌肉脆化特性分析

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

4 小结

第二章 不同脆化阶段草鱼血清酶指标及肠道菌群动态变化

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

4 小结

第三章 不同脆化阶段草鱼头肾、肝脏和肠道组织的超微结构观察

1 材料与方法

2 结果分析

3 讨论

4 小结

第四章 不同脆化阶段草鱼免疫相关基因表达

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

全文总结

参考文献

在读期间拟发表的文章

致谢