食用菌提取物体外降血糖活性筛选模型的建立及活性化合物作用机制的研究

摘要

食用菌是一类营养丰富且无毒副作用的天然食品资源，大量研究表明灵芝、桑黄、北虫草等食药用菌具有明显的降血糖效果。II型糖尿病的主要病征包括胰岛素抵抗、胰岛素分泌相对不足和血糖过高几方面，血糖高于正常水平可由前两种因素或多种因素造成：如二肽基肽酶IV降解肠促胰岛素激素GLP-1导致GLP-1无法刺激小肠或结肠分泌肠胰岛素；或胰岛β细胞受到损伤而选择性凋亡，导致无法分泌足量胰岛素；胰岛素信号通路被阻碍导致细胞发生胰岛素抵抗；细胞糖代谢过程的关键酶失活导致细胞对葡萄糖的摄取利用速度减慢。本论文基于以上几方面分别研究了食用菌提取物及桑黄菌丝体化合物的降血糖活性，并对3种菌丝体化合物原儿茶醛、柚皮素和黄芩素的降血糖作用机制进行了初步探讨。
　　研究主要内容如下：
　　1.建立细胞来源的二肽基肽酶Ⅳ抑制剂筛选模型通过底物显色法并对九种食用菌（桑黄、灵芝、香菇、杏鲍菇、鸡腿菇、灰树花、猴头、姬松茸和蛹虫草）醇提物、桑黄和灵芝的四种有机溶剂（正丁醇、乙酸乙酯、氯仿和石油醚）萃取物、桑黄子实体和菌丝体分离纯化的化合物抑制CHO细胞源性DPPIV活性的效果进行了研究。以H-Gly-pNA?HCl为反应底物，通过底物显色法检测CHO细胞来源DPPIV的活性，优化的筛选模型条件为底物浓度90mmol/L、显色时间60 min、温度37℃、pH7.6，阳性对照药物Ile-Pro-Ile的最佳作用浓度5mmol/L。利用此模型检测供试样品抑制CHO细胞源性DPPIV活性结果表明，桑黄和灵芝的抑制效果明显好于其他7种食用菌；桑黄及灵芝的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等四种萃取相在10和400μg/mL浓度均具有一定抑制效果，其中桑黄及灵芝的乙酸乙酯相抑制效果均好于其他萃取相。对桑黄子实体和菌丝体中分离化合物的DPPIV抑制作用进行了研究，子实体化合物wn-1（麦角甾-7,22-二烯-3β-醇十五酸酯）和wn-3（麦角甾-7,-二烯-3β-醇）DPPIV抑制效果最佳，菌丝体化合物中原儿茶醛、柚皮素和黄芩素的DPPIV抑制效果远高于其他化合物。
　　2.在底物显色法DPPIV抑制剂筛选模型的基础上，进行了检测方法的改进。利用荧光显色法建立细胞来源的DPPIV抑制剂筛选模型，并对九种食用菌醇提物、桑黄和灵芝的四种有机溶剂萃取物、桑黄分离纯化的化合物抑制CHO细胞源性DPPIV活性的效果进行了研究。以Gly-Pro-PNA为反应底物，通过荧光底物法检测CHO（中国仓鼠卵巢细胞）细胞来源DPPIV的活性，优化的筛选模型条件为底物浓度70 mmol/L、温度37℃、pH8.2，阳性对照药物Ile-Pro-Ile的最佳作用浓度1 mmol/L。荧光底物法DPPIV抑制活性检测结果与底物显色法基本一致，桑黄和灵芝醇提物，桑黄和灵芝的乙酸乙酯相，子实体化合物wn-1（麦角甾-7,22-二烯-3β-醇十五酸酯）和wn-3（麦角甾-7,-二烯-3β-醇），菌丝体化合物原儿茶醛、柚皮素和黄芩素都有较好的DPPIV抑制活性。相对于底物显色法，荧光底物法避免了有色样品的颜色干扰，因此结果更加精确。
　　3.利用此模型检测供试样品抑制CHO细胞源性DPPIV活性结果表明，桑黄和灵芝的抑制效果明显好于其他7种食用菌；桑黄及灵芝的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等四种萃取相在10和400μg/mL浓度均具有一定抑制效果，其中桑黄及灵芝的乙酸乙酯相抑制效果均好于其他萃取相。在化合物的DPPIV抑制率测定中，子实体化合物wn-1（麦角甾-7,22-二烯-3β-醇十五酸酯）和wn-3（麦角甾-7,-二烯-3β-醇）DPPIV抑制效果高于其他化合物，其他化合物也都具有一定的DPPIV抑制效果；菌丝体化合物中样品6（原儿茶醛）、样品9（柚皮素）、样品10（黄芩素）的DPPIV抑制效果最佳。
　　4.以高胰岛素诱导的HepG2细胞和地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞两种胰岛素抵抗细胞模型分别对九种食用菌醇提物、桑黄和灵芝的四种有机溶剂萃取物的体外降糖活性进行了研究。HepG2模型研究结果表明，九种食用菌醇提物中灵芝和桑黄醇提物促进细胞葡萄糖消耗效果最好，并且两者高浓度组的葡萄糖消耗量均好于阳性对照组；桑黄三种有机溶剂萃取相（正丁醇相、乙酸乙酯相和石油醚相）和灵芝四种有机溶剂萃取相促进细胞葡萄糖消耗效果较好，均好于阳性对照组。3T3-L1细胞模型结果表明，九种食用菌醇提物中灵芝和桑黄醇提物的促进葡萄糖消耗效果最好，均好于阳性对照组;灵芝及桑黄四种有机溶剂萃取相中，乙酸乙酯萃取相的葡萄糖消耗效果较好。
　　5.利用胰岛素抵抗HepG2细胞模型筛选具有降血糖活性的桑黄菌丝体分离化合物，并对其作用机理进行了初步探讨。研究结果表明原儿茶醛、柚皮素和黄芩素三种化合物对HepG2细胞葡萄糖消耗量具有明显的促进作用，并且在三种化合物中，原儿茶醛和黄芩素分别对SOCS3因子和TNF-α因子表达的抑制作用最强。
　　6.研究了三种桑黄菌丝体化合物原儿茶醛、柚皮素和黄芩素对胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢过程的关键酶己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和α-葡萄糖苷酶酶活性的影响。结果表明原儿茶醛能明显提升己糖激酶酶活，黄芩素能明显提升丙酮酸激酶酶活，但三种化合物基本不具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用。三个化合物主要通过影响糖酵解过程的关键酶加速葡萄糖的摄取利用，无法作为α-葡萄糖苷酶抑制剂延缓淀粉等多糖的分解。

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第一章 绪 论

1.1 II型糖尿病概述

1.2食药用菌降血糖作用及其机制研究概况

1.3体外降血糖活性筛选模型的研究进展

1.4本研究的主要意义及内容

第二章 CHO细胞源性二肽基肽酶IV抑制剂筛选模型的建立及活性提取物筛选

第一节 底物显色法建立二肽基肽酶IV抑制剂筛选模型及活性提取

第二节 荧光底物法建立二肽基肽酶IV抑制剂筛选模型及活性提取

第三章 胰岛素抵抗细胞模型的建立及食用菌提取物降血糖活性的筛选

3.1材料与仪器

3.2 方法

3.3结果与分析

3.4讨论

第四章 桑黄菌丝体化合物降血糖活性及其作用机制研究

4.1材料与仪器

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4讨论

第五章 桑黄菌丝体化合物对胰岛素抵抗细胞糖代谢关键酶的影响

5.1 材料与仪器

5.2 方法

5.3结果与分析

5.4 讨论

全文小结

参考文献

本文创新点

展望

附录名词缩写

致谢

硕士期间发表的文章