一株产壳聚糖酶的海洋菌株Y-116的鉴定、产酶条件和酶学性质研究

摘要

壳聚糖酶可以将壳聚糖水解为壳寡糖，是生物医药、日常洗化、食品工业以及农业发展等诸多领域的研究热点，工业应用前景广阔。本论文从一株分离自黄海海域的产壳聚糖酶菌株出发，通过筛选得到高产菌株Y-116，对菌株Y-116进行了生理生化和分子生物学方面的鉴定，以及发酵培养基成分和产酶条件进行了优化，同时对发酵粗酶液进行初步分离纯化（硫酸铵分级沉淀法和乙醇分级沉淀法），利用制备的壳聚糖酶进行了酶学性质和稳定性研究，以期为将来壳聚糖酶的研究、应用提供基础。 1.本文以壳聚糖酶为研究对象，叙述了产壳聚糖酶菌种筛选的主要方法，优化了菌株Y-116产酶发酵培养条件，使得菌株产酶能力得到提升；并利用粗纯化的酶，探究了该菌所产壳聚糖酶的酶学性质。 2.本文利用透明圈法初筛，再通过摇瓶培养，对比酶活力值，复筛挑选出酶活力较高的菌株，再通过连续传代培养、测定酶活，观察该菌株的遗传稳定性，最后筛选出一株遗传性状稳定，产酶能力较高的菌株 Y-116。通过对菌株 Y-116进行形态分析和生理生化分析对其进行初步鉴定，结果显示：菌株Y-116的革兰氏染色结果为阳性，有芽孢；在琼脂培养基上，菌落形状为规则的圆形，略微凸起，表面光滑，颜色为白色，有粘性且易挑起，随着时间的增加，菌落中间略呈现皱缩状，在显微镜下观察该菌为细长杆状。再结合16S rDNA测序结果及亲缘性对比分析，基本可以得出结论，产壳聚糖酶菌株Y-116属于芽孢杆菌属。 3.为获得较高壳聚糖酶的产量，采用单因素试验法和响应面试验设计，对菌株Y-116发酵培养基各组分和各个培养条件进行了优化。对氮源、碳源、金属离子、NaCl浓度、酵母浸粉浓度、初始pH、接种量、发酵温度和发酵时间8个单因素进行筛选。研究结果表明，利用对比酶活力值，选择相对酶活最高的组别，最终得到各培养组分的最优结果为：乳糖为35 g/L，豆饼粉为30 g/L，培养基初始pH为5.0，Mg2+为2 mmol/L，NaCl为5 g/L，培养温度为30℃，发酵时间为96 h，5%的接种量。再通过Plackett-Burman（PB）设计对影响壳聚糖酶产量的8个主要因素进行评价，确定了豆饼粉浓度、培养基初始pH和Mg2+浓度是影响产酶量的3个主要因素；利用中心组合设计(CCD)及响应面试验分析，确定了主要因素的最优值，即豆饼粉浓度为39.43 g/L，培养基初始pH为5.94，Mg2+浓度为2.05 mmol/L，酶活力比优化前提高了5倍。 4.采用硫酸铵分级沉淀法和乙醇分级沉淀法进行了酶的初步分离纯化，进而探究了制备的壳聚糖酶的酶学性质。结果表明：硫酸铵分级沉淀法最优条件下酶活回收率在87%，酶比活力51.65 U/mg，纯化倍数为4.3；乙醇分级沉淀法最优条件下酶活回收率在60%，酶比活力32.7 U/mg，纯化倍数为2.7，硫酸铵分级沉淀法效果明显优于乙醇分级沉淀法。最适反应温度和温度稳定性结果：在40~55℃条件下，该壳聚糖酶水解反应的速率随着温度的升高逐渐加快，酶促反应速率和相对酶活在55℃时达到最高值；酶液在30~50℃的温度环境下放置1 h，可以保持较高温度稳定性，尤其是当酶液保温温度处于50℃以下时，该酶酶活力的保留值可以超过90%，说明该酶在此温度区间内温度适应性较好，但当保存温度升至60℃时，该酶活力出现部分损失的情况，保温温度超过70℃时，酶活力大幅度下降，该酶基本失去酶活。最适作用pH和pH稳定性结果：在碱性的环境下，壳聚糖酶表现出较低的酶活值和不稳定性，在pH较低的酸性环境中，该酶的酶活力相对较高，且表现出较好的酶活稳定性，当反应环境的pH处于5.5时，达到壳聚糖酶相对酶活力值的峰值。金属离子对酶活力影响结果：Li+、 Ca2+、Al3+能够对壳聚糖酶的酶活产生轻微抑制；Zn2+、Co2+、Fe2+、Cu2+对该壳聚糖酶活性的抑制作用明显；Mg2+、Mn2+、Ba2+离子则能够提高该酶的催化水解活性。总之，该壳聚糖酶酶学性质的探究，显示出该酶具有比较好的应用潜力。

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引言

第一章 文献综述

1.1壳聚糖和壳寡糖概述

1.2壳聚糖酶的概述

1.3壳寡糖的应用

1.4展望

1.5研究目的及意义

第二章 壳聚糖酶产生菌Y-11 6的筛选与鉴定

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3结论

第三章 海洋微生物Y-11 6壳聚糖酶发酵条件优化

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

第四章 海洋微生物Y-11 6壳聚糖酶酶学性质研究

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3 本章小结

第五章 结论与展望

5.1 结论

5.2 研究展望

参考文献

附录

致谢