副溶血弧菌Vp13烈性噬菌体的分离鉴定及生物学特性研究

摘要

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是一种重要的人畜共患病原，不仅引起严重的海水动物弧菌病，而且造成人类的感染，甚至死亡。每年夏秋季节是疾病的暴发期，容易感染鱼类、虾类，贝类以及蟹类等。我国2009年以来暴发的南美白对虾早期肝胰腺坏死症（hepatopancreas necrosis syndrome，HPNS）的病原菌就是副溶血弧菌，给养殖户造成重大经济损失。抗生素因耐药性问题在防治副溶血弧菌所造成的疾病过程中效果愈来愈差，急需开发新型抗弧菌药物。噬菌体作为细菌的病毒，在自然界中具有较高的丰度，具有宿主专一强，不会破坏微生态环境。噬菌体侵染宿主菌后，裂解时会释放出大量的噬菌体，少量噬菌体就能起到防治的效果。副溶血弧菌噬菌体的作用靶点在原核微生物的细胞壁，对动植物细胞上没有相应的作用位点，增加了噬菌体使用的安全性，因此，利用细菌的天敌噬菌体来解决细菌耐药性问题必将是具有广阔前景的生物防治路径。 本研究以副溶血弧菌 Vp13（分离自患病南美白对虾）为宿主菌，分离得到2株烈性噬菌体SX-2和SX-F，通过对SX-2和SX-F的生物学特性以及对感染副溶血弧菌Vp13斑马鱼的保护效果研究，表明噬菌体SX-2和SX-F具有防治副溶血弧菌感染的作用，具有潜在的微生态制剂研发价值。 1.副溶血弧菌Vp13烈性噬菌体SX-2和SX-F的分离与鉴定 从养殖南美白对虾的养殖池塘、东海以及海产品批发市场等采样点共收集77份水样，在对副溶血弧菌噬菌体富集培养的基础上利用二层平板法，分离到2株噬菌体，5次纯化后得到噬菌体SX-2和SX-F。采用磷钨酸负染法，利用透射电镜观察噬菌体的形态结构，电镜结果为：SX-2头部长约110 nm，宽约50 nm，尾部长约150 nm，宽约10 nm，核衣壳为典型的复合对称体制；SX-F头部直径约为56.86 nm，呈正六边形，未观察到尾部，推测其核衣壳为正二十面体对称体制。利用DNaseI、RNaseA、Mung Bean Nuclease及HindШ进行噬菌体核酸类型鉴定，实验结果表明：SX-2和SX-F的核酸都能被DNaseI降解，不能被RNaseA降解，表明遗传物质是DNA；都不能被Mung Bean Nuclease降解，能被HindШ降解表明2者都是双链DNA；2者核酸条带都是只有一个条带，表明噬菌体SX-2和SX-F的核酸都是线形双链DNA。依据国际病毒分类委员会第九次会议分类标准，SX-2符合肌尾噬菌体科特征，SX-F符合盖噬菌体科特征。 2.噬菌体生物学特性及其对感染Vp13斑马鱼的保护效果研究 实验结果显示，噬菌体SX-2和SX-F对温度具有良好的耐受性，60℃条件下处理1h，仍能存活107pfu/mL；SX-2和SX-F对pH具有敏感性，当pH小于3或者大于11时，未检测到SX-2和SX-F噬菌斑。30天时，30%甘油保存的SX-2和SX-F在-40℃和-80℃条件下，SX-2和SX-F的效价分别为3.5×107 pfu/mL、3.7×107 pfu/mL和5.5×107pfu/mL、5.7×107 pfu/mLpfu/mL，保存效果显著高于-20℃、4℃和37℃（P<0.05）。本实验同时分别测定了SX-2和SX-F对85株弧菌的裂解谱的检测，结果显示，噬菌体SX-2能够裂解Vp1、Vp5、Vp3、Vp6、Vp18、Vp21、Vp22、Vp28、Vp33、Vp34、Vp38、Vp44、Vp46、Vp51、Vp52、Vp53、Vp62、Vp79、Vp80、Vp81、Vp82、Vp83、Vp84、K等24种弧菌。噬菌体SX-F能够裂解Vp1、Vp8、Vp9、Vp21、Vp22、Vp25、Vp28、Vp34、Vp38、 Vp44、Vp51、Vp52、Vp53、Vp79、Vp80、Vp81、 Vp82、Vp83、Vp84、K等20种弧菌。其中K为溶藻弧菌，其他都是副溶血弧菌。实验对2株噬菌体进行了最佳感染复数的测定，最佳感染复数均为 0.0001，表明两者均具有较强的裂解能力。实验测定噬菌体一步生长曲线结果表明：噬菌体SX-F的潜伏期约10min，裂解期70min，裂解量为116.2；噬菌体SX-2的潜伏期小于10min，裂解期大约70min。裂解量209.3。2株噬菌体的生物学特性表明2株噬菌体均为烈性噬菌体。体外生长抑制实验表明，噬菌体SX-F和SX-2能够显著降低稳定期宿主菌Vp13活菌的数量（OD600值：SX-2+Vp13，1.486；SX-F+Vp13，1.588；Vp13，1.801）。斑马鱼体内保护实验表明，腹腔注射噬菌体SX-2和SX-F，2株噬菌体都具有很好的保护效果，两者的保护率均能达到62.5%，不同的给药时间，保护的效果有显著的差异，0-4h内保护效果最佳，两者的保护率都达到50%。 3.噬菌体SX-2和SX-F基因组测序分析 噬菌体SX-2有200个ORFs，基因组大小为208581 bp，GC含量为46.84%，具有2个tRNA；噬菌体SX-F有101个ORFs，基因组大小为75838 bp，GC含量为48.80%没有tRNA。通过基因注释，SX-2尾部蛋白有8个；结构功能蛋白有10个；DNA复制和修饰蛋白有23个；转运调节蛋白1个；內溶素蛋白1个；其它功能蛋白16个。基因注释中有24个基因没有在ncbi上比对到同源的序列。SX-F尾部蛋白有2个；结构功能蛋白有5个；DNA复制和修饰蛋白有11个；转运调节蛋白1个；內溶素蛋白1个；其它功能蛋白3个。基因注释中有2个基因没有在ncbi上比对到同源的序列。

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第一章 引 言

1 副溶血弧菌研究概况

2 噬菌体的研究进展

3本研究的目的及意义

第二章 副溶血弧菌Vp13烈性噬菌体筛选及鉴定

1材料与方法

2 结果

3讨论

第三章 噬菌体SX-2和SX-F的生物学特性研究

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

第四章 噬菌体SX-2和SX-F对人工感染Vp13斑马鱼的保护效果研究

1. 材料与方法

2结果

3讨论

第五章 SX-2和SX-F噬菌体基因组测序分析

1 实验仪器及材料

2 结果

3 讨论

全文总结

研究展望

参考文献

致谢