α-环糊精葡萄糖基转移酶中试制备工艺优化及酶的应用评价

摘要

环糊精((Cyclodextrin，简称CD)是一类由环糊精葡萄糖基转移酶(cyclodextrin glucosyltransferase，CGTase，EC2.4.1.19)作用于直链淀粉而产生的环状低聚糖。一般常见的有α-、β-和γ-环糊精，分别由6，7，8个D-吡喃葡萄糖单元，以α-1,4糖苷键首尾相连而成。环糊精具有外侧亲水、内部空腔疏水的特殊性质，它可以包埋众多的各类形状和大小合适的疏水性客体分子，改变它们的稳定性、溶解度、挥发性及化学反应性能等理化性质。在药品、食品、化妆品、环保、工业和农业等方面都能得到广泛的应用。环糊精的制备主要有两种方法：化学合成法和生物酶转化法，化学合成法因为过程复杂等原因已经被淘汰，而生物酶转化法的主要原理是利用环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉或者底物生成环糊精。CGTases酶能催化转糖基化反应，包括环化，耦合，歧化和水解反应，是一种多功能酶。在本实验室前期的研究中，筛选到一株产α-CGTase的来自海洋芽孢杆菌的菌株Y112，并对其进行了菌种鉴定，摇瓶培养条件优化，对α-CGTase酶进行了分离纯化和对酶学性质的研究。本试验在此基础上进行了产α-CGTase酶芽孢杆菌Y112的20 L发酵罐规模的发酵及制备工艺优化、酶转化淀粉制备α-环糊精及酶法改性甜菊苷工艺条件优化，研究结果如下：
　　环糊精葡萄糖基转移酶发酵罐发酵制备工艺条件优化：采用单因素的方法分别对酶在发酵罐发酵过程中的转速、溶氧等因素进行优化，得到20 L发酵罐发酵条件为装液量为10 L，6％的接种量，27℃，转速300 r/min，初始pH9.5，控制溶氧40%，平均酶活性为2140 U/mL，比原始发酵活性提高32.1%；同时对小型发酵罐条件进行了500 L中试放大试验验证；最后发酵液经过絮凝、高速离心、超滤浓缩和冷冻干燥，获得了固体酶粉，总酶活回收率为72.8%。
　　环糊精葡萄糖基转移酶制备α-环糊精的工艺研究：通过单因素法研究酶转化淀粉制备α-环糊精过程中底物种类、底物浓度、加酶量、酶作用时间、作用温度和pH等对转化结果的影响，然后利用Plackett-Burman试验筛选了影响α-环糊精转化率的的3个主要因素（底物浓度，温度、初始pH值）。最终采用响应面分析法得到的最佳转化条件为马铃薯淀粉浓度为5%，加酶量200 U/g淀粉，pH值为8.4，温度30℃，200 r/min反应6 h，α-CD转化率均值为28.67%，比优化前的产率提高了2.48倍。
　　α-环糊精葡萄糖基转移酶酶法改性甜菊苷：先通过单因素试验对酶转化甜菊苷的转化条件进行了优化（反应底物、底物比、反应温度、加酶量、反应时间和体系初始pH值），利用高效液相对转化结果进行了定性定量分析。然后对温度、pH、加酶量和底物比四个因素进行4因素3水平的正交试验，得出在此条件下甜菊苷转化率最高的条件为：以玉米淀粉为糖基供体，温度40℃，pH8.0，底物比1：1，加酶量10 U/g甜菊苷的条件下，反应2.5 h，对甜菊苷的转化率进行测定，结果表明最终的转化率为79.98%。

目录

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引言

第一章文献综述

1.1 环糊精概述

1.2 CGTase酶

1.3 甜菊糖苷

1.4本试验的立题依据及主要研究内容

第二章 环糊精葡萄糖基转移酶规模化发酵制备工艺条件优化及中试放大

2.1 材料与仪器

2.2试验方法

2.3 试验结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 环糊精葡萄糖基转移酶制备环糊精工艺研究

3.1 材料与仪器

3.2 试验方法

3.3 试验结果与分析

3.4 本章小结

第四章 α-环糊精葡萄糖基转移酶酶法改性甜菊苷

4.1 材料与仪器

4.2 试验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 结论与展望

参考文献

附录

致谢