多组分囊泡的相分离和形变动力学

摘要

生物膜中主要是由脂双层和膜蛋白构成的,其中有些特定组成的液相微相区(如“脂筏”)关系到细胞内能量的转换和物质的输运等重要生物物理过程。这些微区的形成被认为是一种相分离过程。但是细胞膜中形成的这些微相区包含上百种磷脂,所以有必要采用合适的生物膜模型来简化问题的研究。本论文基于“脂筏”这种重要功能微区的组成,在实验上构建了DOPC/BSM/Cholesterol的三组分囊泡。通过荧光染色的方法,在显微镜下观察到了相分离过程中微区的形成以及囊泡的形变过程。结合CCD跟踪拍摄的手段可以采集到微区在形成过程中每个阶段的特点,为详细讨论相分离动力学行为提供了可靠的技术支持。
　　本论文就是以生物膜的相分离为背景,利用显微镜以及显微操作仪等手段考察生物膜相分离中微区的形成与长大、膜伴随相分离过程产生的形变以及外加离子和生物分子诱导膜产生的形变等非平衡态特点。主要研究内容如下:
　　(1)在实验上利用类“脂筏”组成:DOPC/BSM/Cholesterol三组分体系进行研究,结合相图讨论了临界点的相分离行为。在相变温度以下,观察到了两种相分离行为:类Spinodal的双连续相区分布和液滴状的单连续相区分布。结合这种不同的相分离行为,讨论了在相分离过程中组分比例、淬冷深度、面积限制、荧光探针以及流体力学作用等的影响。结果表明,临界点对组分非常敏感,微小的波动都可能对最后的相分离行为产生很大的影响。关于液滴状微区的生长过程,进行了详细的动力学研究,得到了微区随时间生长的标度关系。与相关理论研究结果不同的是,实验得到的标度关系呈现一定的阶段性:在微区融合初期,微区随时间的依赖关系为:N～t-2/3;但后期则表现出较快的融合速率,微区数目随时间的变化转变为新的指数关系:N～t-2。这主要是由于在后期微区的凸起造成了各个微区的流体力学效应不再等同,我们尝试用CIC(Collision-InducedCollisions)理论进行了分析解释。
　　(2)主要讨论相分离后期微区长大到一定程度后形变过程中的动力学问题。首先,微区的形变出芽不仅取决于膜的弯曲刚性、界面张力以及内外压差,而且和囊泡的面积体积比以及膜层的厚度有很大的关系。界面张力是微区形成凸芽的推动力,但是由于表面积受限,准球形的囊泡只有在改变内外渗透压的情况下才能使囊泡获得多余的表面积发生出芽。针对面积体积比较大的管形囊泡,详细讨论了出芽的动力学过程;对于膜层较厚的囊泡,由于分相出芽过程中膜层之间存在强烈的偶合效应,所以出芽过程非常缓慢;在凸芽融合后期,不同相区之间达到完全的分离,但是囊泡并未由此而达到平衡态。分离后的两种相区(Lo/Ld)会继续发生变形。一种情况是膜的破裂与重构,另外一种是在有序相区生长出很长的管形凸芽。这是由于相分离过程中,界面线张力推动膜发生凸起导致膜表面应力的增大,而膜的弯曲刚性是有一定限度的。所以当表面应力增到一定程度,囊泡可能通过这两种方式释放内部压力。
　　(3)详细讨论溶血磷脂酰胆碱(Lyso-PC)在相分离前后对“脂筏”组成的囊泡造成的形变动力学问题。首先采用电形成法制备大尺度的巨型囊泡(GUV),然后利用显微操作将Lyso-PC加入到囊泡的边缘。作为一种单链的磷脂,Lyso-PC和囊泡中的鞘磷脂之间会有很强的相互结合力。在相分离前,Lyso-PC具有引起囊泡溶解破坏的作用。在低浓度Lyso-PC作用下,囊泡呈现平滑收缩的过程;高浓度情况下,囊泡会产生剧烈的收缩,并表现出两个不同阶段的动力学标度关系。结合囊泡收缩动力学理论,简单讨论了囊泡在收缩过程中包含的两个阶段:(1)孔的成核;(2)孔的形成和闭合。通过实验得到了囊泡收缩过程中的动力学标度关系:R～t-0.25,R～t-1和理论的分析修正值相吻合;当发生相分离后,通过显微镜可以观察到囊泡表面形成了BSM/Chol富集的类“脂筏”微区。作为液相有序区(Lo),这种结构致密的微区可以抵抗Lyso-PC的抽提破坏。而且,它可以诱导微区发生变形,甚至出芽。利用ADE(Area-DifferenceElasticity)理论模型解释这个过程的发生主要是分子钉扎诱导了脂双层的侧向压力增大,造成了微区的凸起变形。
　　(4)由于钙离子的影响,含胆固醇的磷脂体系会在相变温度以下产生具有动态特征的多边形微区图样。这种体系适用于具有不同长度疏水链的带电磷脂和中性磷脂。在相变温度以下,胆固醇可以和磷脂分子中的羰基以氢键形成复合物造成脂肪酰基链的自由运动减少,引起膜的压缩。所以,胆固醇的存在通过对磷脂堆垛的压缩效应促使膜内每个磷脂所占据的单位面积减小,从而对钙离子的浓度更为敏感。在低温下,钙离子有可能与磷酸根发生络合形成网络状的结构,这种络合可能促进磷脂相态由层状相转变为六角相从而在囊泡表面呈现出规则的六角形排列。微区图样的形状的演化取决于钙离子和磷酸根之间的静电作用力与相边界线张力的大小。如果在相分离后期继续添加钙离子,微区将继续保持多边形的图样。这也进一步说明了这种多边形图样主要是由于静电力的大小决定的。除了钙离子,我们还采用了Na+,Al3+进行类似的实验。结果发现,这两种离子同样可以诱导磷脂/胆固醇发生这种特殊结构的微区。如果把温度回升到相变温度以上时,可以观察到微区消失,囊泡恢复到降温之前的形状。即使反复循环升高、降低温度,都可以看到微区随之形成和消失的过程。因此我们可以认为这种微区的形成是由于相态之间的可逆性转变。