E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链对其表达、转运和折叠的影响及分子机制的研究

摘要

人E-钙粘蛋白(E-cadherin)属于钙粘蛋白家族,是主要分布于上皮组织细胞表面的I型跨膜糖蛋白。它不仅参与了钙离子依赖的细胞间粘附,胚胎发育过程中形态的形成、分化,以及细胞极性的建立和维持,而且它还可以通过其下游结合的连环蛋白分子将胞外的信号传递进胞内。大量文献报道,许多恶性肿瘤的发生都伴随有E.钙粘蛋白表达的下调或缺失。当将E-钙粘蛋白转入恶性肿瘤细胞后,它可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖和转移。因此,目前认为E-钙粘蛋白是一种候选的抑癌基因。
　　 E-钙粘蛋白的分子结构由三部分构成:胞外肽段、跨膜区和胞内肽段。其胞外肽段由5个重复排列的亚结构域(EC1-EC5)组成,每个亚结构域包含一段110个氨基酸残基的肽段。E-钙粘蛋白胞外的5个亚结构域通过与钙离子的结合介导了同种E-钙粘蛋白分子间的粘附。在E-钙粘蛋白的胞外肽段中存在着4个潜在的N-糖基化位点,即位于ECA的Asn-554,566和位于EC5的Asn-618,633。有文献报道,E-钙粘蛋白N-糖基化修饰形式的改变会影响其与粘附复合体(AdherenceJunctionComplexes,Ajs)的结合,进而影响其介导的细胞间的粘附和信号转导。
　　 鉴于E-钙粘蛋白的N-糖基化对其功能影响的重要性,实验室前期通过点突变的方法,分别或联合地将E-钙粘蛋白四个潜在的N-糖基化位点一致序列(N-X-S/T)中的天冬酰胺突变为谷氨酰胺,构建了一系列E-钙粘蛋白不同位点N-糖链缺失株的真核表达质粒,并将这些质粒转入本身无内源性E-钙粘蛋白表达的人乳腺癌MDA-MB-435细胞中,通过筛选获得了不同E-钙粘蛋白N-糖链缺失突变体稳定表达细胞株。前期的实验中发现,Asn-554,566位点的N-糖链与E-钙粘蛋白介导的细胞粘附关系密切,而Asn-633位的N-糖链影响E-钙粘蛋白的表达。当去除该位点的N-糖链后,E-钙粘蛋白由于降解而不能在蛋白水平表达。
　　 已有文献报道,N-糖链参与糖蛋白分子的折叠和维持其空间结构的稳定性。当去除特定位点的N-糖链后会导致一些糖蛋白折叠错误,从而经内质网相关蛋白降解通路(ER-associatedDegradation,ERAD)降解。因此为了深入阐明E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链对其降解的影响,在本文的第一部分首先应用蛋白酶体的特异性抑制剂MG132处理稳定表达E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的细胞株,结果发现,MG132可以有效的阻断该E-钙粘蛋白突变体的降解,使其重新表达。而且在该株细胞内还检测到了E-钙粘蛋白与泛素结合在一起,形成一系列不同分子量的多聚泛素化条带。然后我们应用ERAD途径的特异性抑制剂DMM处理稳定表达E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的细胞株,结果发现,DMM也可以有效的阻断该E-钙粘蛋白突变体的降解,同时在该株细胞内也检测到了p97分子与E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的特异性结合。这些结果表明,Asn-633位N-糖链的缺失导致E-钙粘蛋白经ERAD途径被蛋白酶体降解。
　　 在本文的第二部分中,我们进一步探讨了Asn-633位N-糖链的去除对E-钙粘蛋白分子折叠的影响。我们首先检测了E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体与α-连环蛋白、β-连环蛋白及p120的结合。研究发现,Asn-633位N-糖链缺失突变体能够与β-连环蛋白及p120结合。说明其胞内肽段的空间结构受Asn-633位N-糖链缺失的影响较小,依然保留了生物活性。另外我们检测了E-钙粘蛋白不同N-糖链缺失突变体与calnexin的结合,结果显示calnexin参与了E-钙粘蛋白N-端的折叠,在所有的突变体中均检测到了与calnexin的结合。但是相比其它突变体,E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体与calnexin的结合量显著升高,说明其N-端折叠发生错误。然后我们应用同源构模的方法模拟了E-钙粘蛋白胞外肽段的空间结构,结果显示Asn-633位点位于E-钙粘蛋白胞外肽段第五亚结构域(EC5)的核心区内,提示该位点的N-糖链可能参与维持该核心区空间结构的稳定。
　　 有文献报道,并不是所有的ERAD底物都会滞留在内质网中,有些错误折叠的蛋白质的有效降解是依赖于其在内质网—高尔基体间的转运。因此,在本文的第三部分,我们重点研究了在阻断了E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体降解的情况下,其胞内的分布模式。免疫荧光及TdtonX-100抽提的实验证实,当阻断了ERAD途径后,E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体可以重新表达,但其细胞内的分布模式发生了改变。E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体不能被投递到细胞膜上,而是主要分布于胞质中。与之相对应的是,当仅保留Asn-633位N-糖链而去除其它三个位点的N-糖链后,E-钙粘蛋白依然可以被正确的投递到细胞膜上。接下来,我们应用凝集素染色和糖苷酶处理的方法,对E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的N-糖链类型进行了分析,研究发现,其N-糖链被修饰为未成熟的高甘露糖类型,提示E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体不能被分泌到高尔基体中去。
　　 当E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体被降解后,与其结合在一起的β-连环蛋白的命运将会怎样?在本文的第四部分中,我们重点探讨了E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的降解对β-连环蛋白的影响。研究发现,E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的降解会促使与其结合在一起的β-连环蛋白降解。值得注意的是,这部分降解的β-连环蛋白没有发生丝/苏氨酸磷酸化。进一步的研究发现,在稳定表达E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体的细胞内,β-连环蛋白通过与p97的特异性结合被包装进反向转运复合物中。
　　 本论文研究发现,Asn-633位的N-糖链影响E.钙粘蛋白的表达、转运和分子折叠。当去除该位点的N-糖链后,E-钙粘蛋白的N-端肽链发生折叠错误,从而被内质网中的伴侣分子识别并将其多聚泛素化,最后被p97反向转运到胞浆中降解。在E-钙粘蛋白Asn-633位N-糖链缺失突变体降解的过程中,与其结合在一起的β-连环蛋白也一起被降解。而且这部分β-连环蛋白的降解是不依赖于其丝/苏氨酸磷酸化的。