整合素avβ3受体显像无创性评估大鼠肝纤维化的可行性研究

摘要

肝纤维化(liver fibrosis)是不同病因引起的肝脏慢性损伤后实质再生，同时伴随间质过度增生，潜在可逆的组织修复重建过程。肝纤维化评估对于慢性肝病的诊断和干预评价尤为重要，目前还没一种可靠的肝纤维化无创性评估方法。肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化和表型改变是肝纤维化发生的中心事件，决定着肝纤维化转归。血管新生(angiogenesis)是组织损伤修复的必要条件。HSC活化、细胞外基质(extrocellural matrix，ECM)增多同时伴有新生血管形成是进展性肝纤维化修复重建中突出的病理特征。
　　 整合素(integrin)是黏附分子家族中，由一个α亚基和一个β亚基非共价结合形成的跨细胞膜受体，介导细胞和ECM、细胞与细胞间的黏附和整合细胞内外信息传递。生理情况下整合素为细胞非组成性表达，在整合素家族中各亚型的表达有时序性和分布特异性。整合素αvβ3亚型是最广泛的ECM受体，主要介导间质细胞与纤维连接蛋白、纤维蛋白原、Ⅰ型胶原、玻璃黏结蛋白、层黏蛋白、Ⅷ因子相关抗原(vWF)等ECM的黏附，并和血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子β1(TGFβ-1)、内皮细胞生长因子(VEGF)等细胞因子有信号协同作用，主要传递和细胞增殖、分化、运动、分布、定居、生存或凋亡等有关的细胞信号。正常肝组织仅门静脉周围表达少量整合素αvβ3，肝细胞、库普弗细胞、静止HSC和正常血管内皮细胞不表达该亚型。实验研究了整合素αvβ3在活化HSC和肝纤维化组织中的表达，探讨整合素αvβ3表达、血管新生与肝纤维化间质重塑的关系。
　　 精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGO)三肽模体是ECM中保守序列，也是ECM和整合素受体识别常见位点。整合素αvβ3能识别ECM中特异构象的RGD配体。人工合成含RGD肽链高通量筛选发现，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)酪氨酸-赖氨酸(RGDyK)、精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-赖氨酸(或RGDfK)等五肽分子也能和整合素αvβ3受体特异结合，对五肽中赖氨酸上活性氨基进行小分子修饰并不影响受体与配基结合活性。实验中通过固相合成整合素αvβ3受体的RGD环肽(cRGD)配基，设计用羧基荧光素(FAM)和锝99同位素(99mTC)等示踪分子标记cRGD作为探针，探讨人工合成的cRGD配基对活化HSC和肝纤维化组织的靶向性结合是课题研究的主要工作。
　　 建立在肝纤维化组织间质重建的分子病理基础上，以99mTC标记的cRGD为示踪分子，通过单光子发射型计算机断层成像(SPECT)探测肝纤维化不同时期肝脏放射性活度的相对变化(肝脏/心脏计数比值)，并和常规B型超声、磁共振仪(MRI)比较早期肝纤维化的影像表现。尝试应用分子影像方法，根据肝脏中整合素αvβ3受体结合cRGD配基的变化信息，来反映慢性损伤肝组织重建过程中活化细胞水平及与肝纤维化程度的关系，为建立一种敏感、特异、可靠的肝纤维化无创性受体显像评估方法的可行性提供实验依据。
　　 课题研究分为以下六部分；
　　 第一部分、HSC的分离、培养、鉴定和体外活化模型的建立
　　 目的：建立一种稳定可靠的HSC分离方法，为体外研究提供细胞模型。
　　 方法：Hank’s液在体灌洗大鼠肝脏，离体后用Ⅳ胶原酶、链蛋白酶、DNaseI消化肝脏，11％Nycodenz连续梯度液分离出大鼠HSC，计数细胞得率，0.2％台盼蓝染色计算细胞活率。自发荧光、透射电镜、苏丹Ⅲ染色观察细胞脂滴，Desmin、α-SMA免疫化学和荧光染色对HSC进行鉴定和纯度分析。分离后HSC按1-4×106密度接种于未包被塑料培养瓶或皿，含10％胎儿牛血清DMEM培养基，37℃含5％CO295％空气培养箱中培养，通过延长培养诱导HSC活化。
　　 结果：分离HSC得率3.5±0.8×107/只大鼠，细胞活率>9096，分离第1天自发荧光和第3天desmin染色阳性细胞>90％。HSC随着体外培养形态明显改变，分离培养7天后α-SMA阳性细胞>90％，培养14天或传代后>95％阳性。
　　 结论：肝脏离体后消化能达到在体消化同样的效果，应用Nycodenz密度分离介质可获得满意HSC得率和纯度。新分离大鼠HSC培养7天后超过90％激活表型转变为活化HSC。
　　 第二部分、整合素αvβ3受体在HSC活化过程中的表达
　　 目的：探讨HSC表型转变过程中整合素αvβ3受体和α-SMA的定性、定位、定量表达。
　　 方法：HSC培养的第1、3、5、7和14天分别提取细胞总RNA和总蛋白。总RNA逆转录合成cDNA，分别通过real-time PCR和Western Blot分析整合素αv、β3和α-SMA mRNA和蛋白质在HSC活化过程中的表达。静止期细胞和激活细胞期HSC，分别进行α-SMA和整合素αvβ3细胞免疫荧光染色激光共聚焦观察。
　　 结果：HSC活化过程中整合素αvβ3表达水平变化有显著性差异(P<0.01)，第14天时在mRNA和蛋白质水平比第1天，分别增加18倍和5.2倍。而比较7天和14天时表达则无明显差异。免疫荧光双染色显示活化HSC中整合素αvβ3极性表达于细胞膜，α-SMA表达于细胞浆并且和整合素αvβ3有共定位。
　　 结论：整合素αvβ3是激活状态HSC的表型受体，表达上调与HSC活化和活化状态维持有关。
　　 第三部分、整合素αvβ3 RGD环肽配基与HsC的结合分析
　　 目的：研究HSC对羧基荧光素(FAM)标记精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-赖氨酸(FAM-cRGD)环五肽的结合和内化。计算活化HSC对125I标记精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)酪氨酸-赖氨酸的亲和力和受体容量。
　　 方法：采用C末端保护固相法合成精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-赖氨酸环五肽，羧基荧光素合成树脂上和环五肽中赖氨酸上的氨基固相结合为标记的荧光分子探针(FAM-cRGD)。高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)检测FAM-cRGD的纯度和分子量。荧光示踪观察HSC对FAM-cRGD探针的摄取和内化。流式细胞仪(FCM)分析HSC孵育FAM-cRGD后细胞平均荧光强度的变化和浓度、时间效应。受体放射性配基结合分析(RBA)测定HSC对125I标记精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-(右旋)酪氨酸-赖氨酸的平衡解离常数(Kd)和最大结合点数(Bmax)。
　　 结果：荧光示踪显示静止HSC不结合FAM-cRGD探针，活化HSC结合FAM-cRGD并摄入细胞浆，但无细胞核的内化。流式细胞仪分析提示，静止期HSC和10μmFAM-cRGD37℃孵育45分钟，平均荧光强度和本底比较无明显变化。而活化HSC和10μM FAM-cRGD37℃孵育45分钟，平均荧光强度较本底增高6.6倍，活化HSC和10μM FAM-cRGD、150μM cRGD37℃共同孵育45分钟，平均荧光强度抑制超过30％，活化HSC平均荧光强度改变有随FAM-cRGD孵育浓度和孵育时间延长而增加的趋势。受体放射性配基结合分析，通过Scatchard作图法求出活化HSC对cRGD结合的Kd为4.808×10-9mol/L和Bmax为2.112×10-10mol/L。
　　 结论：活化HSC能与整合素αvβ3受体的cRGD发生受体-配基样结合，活化HSC对cRGD配基有较高的亲和力和受体容量。
　　 第四部分、肝纤维化中的整合素αvβ3表达与血管新生
　　 目的：建立两种大鼠肝肝纤维化模型，探讨肝纤维化组织中整合素αvβ3表达及与血管新生的关系。
　　 方法：硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射和胆总管结扎(BDL)诱导建立两种大鼠肝纤维化模型。建模的第3周末、9周末分别进行肝组织天狼星红染色和计算机图像分析、整合素αvβ3和血小板内皮细胞黏附分子(CD31)免疫化学染色、整合素αvβ3和与α-SMA免疫荧光双重染色及激光共聚焦观察和real-time PCR和Western blot分析肝组织中整合素αvβ3、CD31在mRNA和蛋白表达水平表达的相对定量。
　　 结果：肝纤维化程度随建模时间延长而加重。两种肝纤维化大鼠和对照大鼠比较，肝组织中整合素αvβ3和CD31在mRNA和蛋白表达水平有显著性差异(TAA组F=28.66，P<0.01和F=19.62 P<0.01，BDL组F=32.60 P<0.01和F=42.36P<0.01)，随肝纤维化进展而有升高的趋势。免疫组织化学和免疫荧光化学染色提示，在肝纤维化扩大的汇管区及纤维隔中有新生血管形成，在间质中整合素αvβ3与α-SMA表达部位一致，从汇管区向肝实质深入。
　　 结论：肝纤维化进展中整合素αvβ3表达水平增加与HSC活化和血管新生有关，并与间质重建程度平行。
　　 第五部分、肝组织整合素αvβ3放射自显影和125I-cRGD在体内的分布
　　 目的：分析肝纤维化组织对125I-cRGD配基的结合，和125I-cRGD在早期肝纤维大鼠中的分布。
　　 方法：硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射诱导大鼠肝纤维化，在第3周末、9周末分别进行肝组织冰冻切片，切片分别和125I-cRGD、125I-cRGD加500倍化学剂量cRGD(特异阻断)进行4℃孵育2小时，冲洗切片后接触法暴光2周，进行受体组织放射自显影。6只正常大鼠和6只TAA3周肝纤维化大鼠，各3只分别进行尾静脉注射6μCi125I-cRGD，各3只注射500倍化学剂量cRGD特异阻断后再注射6μCi125I-cRGD、在注射后45min分别取材肝、脾、脑、肾、心、肺和肌肉，测定各脏器的放射性活度，计算各脏器放射性比活度(％ID/g)。
　　 结果：正常大鼠、TAA3周、TAA9周大鼠切片暴光后的相对灰度分别为8.1±1.6、18.7±2.6和28.7±3.4，用cRGD阻断的切片相对灰度分别为7.7±1.7、12.1±2.5和19.3±3.3，三组间比较差异有显著性(P<0.01)。在TAA3周和TAA9周中，未用cRGD阻断和cRGD阻断比较差异有显著性P=0.02和P=0.041，阻断的切片中相对灰度降低。正常大鼠和TAA3周的早期肝纤维化大鼠中，125I-cRGD体内分布以肾脏组织中最高，其次是肝脏，脑组织最低。正常大鼠中肝脏125I-cRGD的分布％ID/g，在未阻断和阻断大鼠分别为0.11±0.03、0.10±0.04，在TAA3周大鼠分别为0.17±0.02和0.12±0.03，4组比较F=5.175，P=0.049差异有显著性，TAA3周大鼠肝脏中的％ID/g较高，在用cRGD阻断时肝脏中放射性比活度有下降的趋势。而比较各组间肾、脾、心、肺、脑、肌肉等脏器放射性比活度则差异无显著性。
　　 结论：体内外的研究提示肝纤维化组织对125I-cRGD配基有较高的结合和摄取，并能被未标记的cRGD所竞争。
　　 第六部分、肝脏整合素αvβ3受体显像评估肝纤维化
　　 目的：以99mTc-DTPA-cRGD为示踪剂应用SPECT对肝纤维化大鼠肝脏中整合素αvβ3受体进行分子显像，测定正常和肝纤维化大鼠间肝/心的放射性计数的比值。
　　 方法：硫代乙酰胺(TAA)腹腔诱导大鼠肝纤维化。合成树脂上二亚乙基三基三胺五乙酸(DTPA)固相结合cRGD(DTPA-cRGD)，高锝酸盐(99mTc04-)氯化亚锡还原法标记DTPA-cRGD(99mTc-DTPA-cRGD)，纸层析法测定放射化学纯度。TAA3周早期肝纤维化大鼠进行肝脏B型超声和MRI扫描观察影像表现。在TAA3周和TAA9周，尾静脉注射99mTc-DTPA-cRGD6mCi/只，用小动物SPECT进行大鼠腹部扫描，计算注药后45min，感兴趣区(ROI)的肝/心放射性计数比。
　　 结果：测定99mTc-DTPA-cRGD的放射化学纯度>95％，室温下4小时保持稳定。注射99mTc-DTPA-cRGD后45min，正常组、TAA3周和TAA9周组中感兴趣区的肝/心放射性计数分别为1.73±0.35、2.7±0.44、3.73±0.65差异有显著性(F=13.1，P=0.006)。比较正常大鼠和TAA3周大鼠，TAA3周和TAA9周大鼠组间感兴趣区的肝/心放射性活度比值差异有显著性(P<0.05)。常规MRI和B型超声检测TAA3周的早期肝纤维化大鼠和正常大鼠在影像上无区别，SPECT扫描提示TAA3周大鼠肝脏对99mTc-DTPA-cRGD的积聚增加。
　　 结论：肝纤维化大鼠99mTc-DTPA-cRGD SPECT显像肝/心放射性计数比值较正常大鼠明显增加与肝组织中整合素αvβ3受体表达上调有关。SPECT和常规影像比较能提示早期肝纤维化中对99mTc-DTPA-cRGD摄取增强后的影像改变。