中电导钙激活钾离子通道对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及调控机制

摘要

子宫内膜癌(endometrialcarcinoma,EC)是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,发病率大约为15-20/100,000,严重威胁妇女的健康和生命。随着科技和医疗的发展,子宫内膜癌的治愈率逐渐提高,但是特殊病理类型和晚期子宫内膜癌五年的存活率还是很低。尽管对子宫内膜癌的病因和发病机制有许多学说,但目前为止,人们对于子宫内膜癌的具体病因和发病机制还不清楚。研究发现,包括钾离子通道在内的离子通道在肿瘤细胞的增殖中发挥了重要作用,本课题组的前期研究则显示中电导钙激活性钾离子通道(intermediate-conductanceCa2+-activatedK+channels,KCa3.1)在子宫内膜癌组织中高表达,并能促进子宫内膜癌细胞的增殖[1],在此基础上,本课题将进一步研究中电导钙激活钾离子通道对子宫内膜癌细胞株生物学行为的影响,并探讨可能的分子作用机制。
　　 本课题共分三部分:①中电导钙激活钾离子通道对子宫内膜癌细胞增殖、周期调控及凋亡的影响;②中电导钙激活钾离子通道对子宫内膜癌细胞迁移和侵袭的影响;③表皮生长因子对中电导钙激活钾离子通道表达的影响及其相关分子机制。
　　 第一部分中电导钙激活钾离子通道对子宫内膜癌细胞增殖、周期调控及凋亡的影响
　　 目的：利用KCa3.1siRNA表达质粒及其特异性阻断剂TRAM-34抑制KCa3.1的表达和活性,探讨KCa3.1表达及活性的改变对子宫内膜癌细胞增殖、周期调控及凋亡的影响。
　　 方法：将携有KCa3.1干扰RNA基因片断的质粒转染子宫内膜癌细胞株HEC-1-A、Ishikawa细胞,以转染阴性对照质粒及未转染(空白对照)的细胞作为对照,用Realtime-RT-PCR技术及Westernblot法检测KCa3.1的表达变化。应用MTT比色法、BrdU掺入法、流式细胞仪、Realtime-PCR及Westernblot法研究KCa3.1相对特异性阻断剂TRAM-34和KCa3.1siRNA表达质粒对子宫内膜癌细胞株增殖、周期调控及凋亡的影响。
　　 结果：KCa3.1siRNA表达质粒可以显著抑制KCa3.1基因及蛋白的表达,与阴性对照质粒转染组及空白对照组相比差异有统计学意义;加入TRAM-34及转染KCa3.1siRNA表达质粒可以显著抑制HEC-1-A、Ishikawa细胞的增殖;2株细胞的G0/G1百分比上升,S期百分比下降,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),而细胞凋亡率与对照组相比却无显著差异(P＞0.05);细胞蛋白CyclinD1、CyclinE及Survivin的表达水平降低,与对照组相比差异具有统计学意义。
　　 结论：抑制KCa3.1通道表达及活性可以抑制细胞增殖,阻碍子宫内膜癌细胞周期进展,但对细胞凋亡无显著影响。
　　 第二部分中电导钙激活钾离子通道对子宫内膜癌细胞迁移和侵袭的影响
　　 目的：利用特异性阻断剂TRAM-34抑制KCa3.1的活性,探讨钙激活性中电导钾离子通道(KCa3.1)活性改变对子宫内膜癌细胞运动和侵袭的影响。
　　 方法：利用特异性阻断剂TRAM-34,应用划痕实验、运动实验、Transwell小室侵袭实验了解KCa3.1对子宫内膜癌细胞运动和侵袭能力的影响,并用RT-PCR及Westernblot法检测TRAM-34作用前后MMP-2表达的改变。
　　 结果：(1)TRAM-34可以显著抑制HEC-1-A、Ishikawa细胞的运动和侵袭能力,与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01);(2)与对照组相比,TRAM-34处理后MMP-2的基因和蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论：抑制KCa3.1通道活性可以降低子宫内膜癌细胞的运动和侵袭能力,这可能与下调MMP-2的表达有关。提示KCa3.1可以促进子宫内膜癌细胞的运动和侵袭,它的表达和/或功能异常可能在子宫内膜癌的转移中起重要作用。
　　 第三部分EGF对子宫内膜癌细胞KCa3.1表达的影响及其相关分子机制
　　 目的：研究EGF对子宫内膜癌细胞KCa3.1表达的影响及其相关分子机制。
　　 方法：将EGF以不同浓度(0、1、10、20ng/ml)分别作用于HEC-1-A细胞或Ishikawa细胞不同时间(0、12、24、48、72h),采用Westemblot法检测KCa3.1表达水平。以10ng/mlEGF分别作用于HEC-1-A细胞或Ishikawa细胞不同时间(0、5、15、30、60、120min),分别测定AKT和ERK1/2的磷酸化水平,并应用特异性的MAPK通路阻断剂PD98059抑制ERK1/2的磷酸化、特异性的P13K/AKT通路阻断剂LY294002抑制AKT的磷酸化和相对特异性阻断剂TRAM-34降低KCa3.1的活性,研究信号通路MAPK、P13K/AKT与KCa3.1之间的相互关系。
　　 结果：(1)随着EGF浓度的增加,HEC-1-A细胞或Ishikawa细胞的KCa3.1的蛋白表达明显增加,与对照组相比,EGF浓度达10ng/ml时,KCa3.1的表达变化具有统计学差异(P＜0.05),其后略有下降;随着EGF作用时间的延长,HEC-1-A细胞和Ishikawa细胞的KCa3.1蛋白表达水平逐渐增强,48小时达高峰,此后KCa3.1表达水平呈下降趋势。(2)10ng/mlEGF可以引起HEC-1-A细胞和Ishikawa细胞的p-ERK1/2和pAKT表达的明显增强,ERK1/2和AKT的表达无明显变化。MAPK信号通路的阻断剂PD98059和P13K/AKT信号通路的阻断剂LY294002分别可抑制EGF引起的ERK1/2和AKT的磷酸化,进而引起KCa3.1的表达下降。(3)KCa3.1通道的相对特异性阻断剂TRAM-34可以阻断EGF引起的ERK1/2的磷酸化,对AKT的磷酸化水平没有影响。
　　 结论；EGF通过MAPK和P13K/AKT通路促进子宫内膜癌细胞KCa3.1的表达;KCa3.1在EGF激活MAPK信号通路过程中发挥一定作用。
　　 综上所述,KCa3.1可促进子宫内膜癌细胞株HEC-1-A和Ishikawa细胞的增殖、周期进展、迁移和侵袭。EGF可以通过MAPK和P13K/AKT信号通路促进子宫内膜癌细胞KCa3.1的表达,同时,KCa3.1的活性改变对ERK1/2的激活具有一定的调节作用。本课题的研究为进一步研究子宫内膜癌的发病机制提供了新的思路,为子宫内膜癌的药物治疗提供了新的思路和靶点。