定量蛋白质组学解析博来霉素诱导下的肝癌细胞中的H2AX蛋白复合物

摘要

DNA损伤应答是细胞对于外界刺激的主要响应方式。许多体内,体外的因素都能够造成DNA的损伤,细胞因而就进化出了一整套应对损伤,保护自我的方式。当这种方式发生突变或者损毁,就不能够及时帮助细胞修复损伤,那么就很可能造成细胞基因组的不稳定性而产生癌变,或者凋亡。所以DNA损伤与肿瘤的发生、发展有密切的关系。而另一个方面,对于肿瘤的治疗也是通过损伤肿瘤细胞中的DNA为基础的,但由于肿瘤的抗药性,往往以放疗和化疗为主的肿瘤临产治疗会产生过度的副作用,杀死正常细胞,严重的损失正常的生理功能。这样来看,就非常有必要了解肿瘤细胞对于DNA损伤响应的分子机制。而H2Ax是DNA双键断裂的生物标志物,DNA双键断裂又是最为严重的DNA损伤方式。那么研究H2AX复合物在肿瘤细胞和正常细胞中在抗肿瘤药物诱导的DNA损伤条件下的变化情况以及差异就显得十分重要。而Rad52是DNA同源重组的重要分子,现在对其研究还不是十分-深入,但它的生物功能却是十分重要的。肝癌是我国人民最常发生的恶性肿瘤,这与人的遗传信息以及环境都有重要的关系。所以我们就以H2AX和Rad52为中心,以具有相同遗传学背景的正常肝细胞7701与肝癌细胞7703为载体,来研究DNA损伤修复机制。我们采用的方法是蛋白质组学技术,生物信息学技术以及细胞生物学方法。值得注意的是,我们国家在对肝脏的蛋白质组学研究已经走在了世界的前沿,这也给我们的课题提供了足够的理论基础。本实验中,我们主要采用本组成熟的“双标签”定量蛋白质组学技术,对H2AX和Rad52蛋白复合物进行定性鉴定和定量分析。
　　1.定量蛋白质组学和生物信息学鉴定和分析博来霉素诱导下H2AX复合物
　　由于H2AX不但在DNA损伤信号感应,传导和招募修复因子中发挥至关重要的作用,还与基因组稳定性有密切的关系,与肿瘤的发生、发展紧密相关,可用来作为肿瘤的早期检测。博来霉素是经典的抗肿瘤药物,重要用于生殖细胞癌、头颈癌、淋巴癌的临产治疗,其抗肿瘤的分子机制是作为一种射线类似物来使细胞产生DNA双链断裂和单链断裂。本文采用“双标签”的定量蛋白质组学策略,定量研究正常肝细胞和肝癌细胞内H2AX复合物在博来霉素诱导的DNA损伤下的变化情况。鉴定到了以前文献报道的一些H2AX相互作用蛋白,还鉴定到了更多的以前未报到过的H2AX复合物成分。这些蛋白参与了细胞对于DNA损伤的各方面应答,包括DNA修复,细胞周期检测点,凋亡,染色质重塑,转录调控,RNA末端处理等生物过程,体现了其广泛的生物学功能。
　　我们进一步的对所新鉴定到的H2AX相互作用蛋白进行DNA修复通路上的研究,发现了除了已知博来霉素诱导的DNA修复通路,非同源末端连接和碱基切除修复通路外,以前未曾报道过的与博来霉素有关联的核苷酸切除修复和错配修复通路中都参与到了H2AX相互作用网络。这样极大的提高了对肿瘤细胞对于抗癌药博来霉素造成的DNA损伤修复的多样性,暗示了肿瘤细胞对于抗肿瘤药物的高度抗性。而这些修复通路又是通过H2AX串联起来的,很可能是H2AX扮演了一个协调不同通路共同作用的角色。这样看来这些H2AX相互作用蛋白很可能作为潜在的肿瘤治疗的生物靶点,可以用来辅助抗肿瘤药物的临产治疗。
　　不仅是多样的DNA修复通路,我们通过基于定量信息和功能结构域的蛋白相互作用组学聚类分析,基于蛋白质结构和相互作用程度的信息来发现新鉴定到的H2AX相互作用蛋白集中的参与到更多其他的信号通路中。一些在结构上类似的蛋白质共同组成了一些信号通路的分子基础。不同的信号通路的蛋白,以及不同位置的蛋白质通过与H2AX不同程度的相互作用关系参与到其调控网络中来。这样以H2AX为中心,当细胞受到外界刺激时,H2AX能够协调一系列复杂,多层次,多出路的调控网络来控制细胞的应答,躲避威胁。从蛋白质组学数据和细胞生物学结果可以看出肿瘤细胞进化出来更加紧密的调控机制来应对损伤,表现出了其强大的生命力。
　　因此我们采用的“双标签”的蛋白质组学策略和后续的生物信息学分析很好的帮我们了解了肝肿瘤细胞和正常肝细胞中H2AX复合物在博来霉素刺激下的变化情况,使得我们对H2AX为中心的DNA损伤调控机制有了更新更全面的认识。为以后以寻找肿瘤治疗的方案提供了独特的分子依据。
　　2.定量蛋白质组学鉴定和分析Rad52复合物
　　RAD52属于RAD52家族,目前已发现成分有RAD50、RAD51、RAD51B、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RAD59等,还不断有新成分被发现。RAD52主要通过DNA的同源重组(HR)来修复DSBs。新的研究发现RAD52可能在DNA损伤修复的多个环节起作用,并与多种DNA损伤修复相关的蛋白质的活化有密切关系,但是至今对Rad52的研究还不是非常充分,仍有许多空白需要填写。本节采用与上节相同的“双标签”定量蛋白质组学策略,定量研究正常肝细胞和肝癌细胞RAD52蛋白复合物的结合情况。鉴定了200多个相互作用蛋白,涉及参与蛋白代谢、合成、细胞周期调控与增殖、转录、运输、细胞骨架及凋亡等生物学过程和功能。我们通过对这些蛋白的功能分析,发现在正常肝细胞和肝癌细胞中,与RAD52相互作用多数蛋白都与核酸代谢及蛋白代谢相关。但进一步的分析发现在肝癌细胞中存在一类抗凋亡的蛋白;同时在正常肝细胞中存在一类与防御有关的蛋白。这些结果提示在RAD52相关的修复通路上,正常肝细胞与肝癌细胞各种有他们的独特性。由于本实验只是做了一个初步的研究,后续的研究将就以RAD52为中心探讨肿瘤抗药性的分子机理,以及RAD52蛋白复合物在DNA损伤条件下的网络应答调控。这部分数据结果将与上述H2AX复合物的数据合并起来,为我们认为DNA损伤修复机制,以及与肿瘤之间的相互联系提供充分的数据。并且希望这些实验结果能够为筛选肿瘤治疗的靶标提供候选对象。