结核不同感染状态下宿主对结核特异性抗原获得性免疫应答的差异及相关分子标识筛选

摘要

结核病是由结核分枝杆菌所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。近年来，结核病疫情越来越严重，其感染后引起患者的死亡率位居我国传染病的首位。目前全球约有1/3的人口感染结核杆菌，每年新发的活动性结核病人有900多万人，并且每年有近200万人死于结核病。大多数人感染结核菌后并无临床症状，称为潜伏感染。但是有10％的潜伏感染者将在其一生的某个阶段发展为活动性结核。潜伏感染不断转化为活动性结核，是造成结核病发病率居高不下的重要原因。因此，潜伏感染者为结核病的控制和诊断带来了巨大的挑战。然而，对于机体如何控制潜伏感染，以避免发展为活动性结核的关键免疫机制仍知之甚少，同时临床亦缺乏鉴别潜伏感染与活动性感染的生物靶标。因此，全面的研究活动性结核与潜伏感染的免疫应答差异对进一步揭开抗结核免疫的机制和发展新的结核诊断方法具有重要意义，也为提出新型的结核病控制策略奠定基础。
　　本研究首先用人全基因组表达谱芯片的方法，寻找结核不同感染状态者的获得性免疫在应答PPD刺激时的差异。我们入选了4名活动性结核患者(TB)，4名潜伏感染者(LTBI)及4名未感染结核菌的健康对照者(HC)。采其外周血分离外周血单个核细胞(PBMCs)，用结核特异性抗原PPD刺激培养4小时，设置未刺激的PBMCs作为自身对照，消除本底差异。用双荧光标记杂交的方法，将来自于同一人的两份RNA在同一张芯片上进行杂交。对芯片结果的统计分析显示，TB组和LTBI组的PBMCs对PPD刺激的应答差异最为明显，我们从中筛选到了286个差异表达基因;TB组与HC组的差异基因数目与上述两组相当，差异表达基因为239个;LTBI组与HC组的差异最小，差异表达基因为94个。最终，我们通过维恩分析得到了506个在三组组间比较中差异表达的基因群。随后用生物信息学的方法，我们又对差异表达的基因的功能进行了分析。GeneOntology(GO)分析发现，胞外组分及应对外来刺激的基因簇在LTBI组与HC组的差异表达基因中被显著富集;与应对外来刺激相关的基因簇也在TB组与LTBI组间存在差异;TB组与HC组的差异基因簇最多，主要集中在受体结合、信号转导、胞外组分、应对刺激、免疫系统调节和细胞通信等几个方面。
　　随后，我们又对结核感染者及活动性结核患者的PBMCs在PPD刺激时的特有免疫应答进行研究。我们比较了(1)结核感染者(TB组和LTBI组)与健康对照者（HC组）的PBMCs在应答PPD刺激的差异;(2)活动性结核患者(TB组)与无临床症状者（LTBI组和HC组）的PBMCs在应答PPD刺激的差异。最终我们分别得到了由55个基因所组成的结核感染者的特有的基因表达谱，及由229个基因所组成的活动性结核特有的基因表达谱。GO分析发现，结核感染表达谱的差异基因在受体结合、应对胞外刺激和细胞增殖调控几个方面被显著富集;活动性结核基因表达谱中的229个基因在受体结合、胞外成分、应对胞外刺激、信号转导、细胞膜结构、慢性炎症调控和细胞增殖调控几个方面被显著富集。
　　为了验证表达谱芯片的结果，我们进行了实时定量PCR(qPCR)验证实验。为此，我们另外招募了83名参与者，其中TB组为25名，LTBI组为36名，HC组为22名。结果显示，81％的qPCR结果与芯片试验结果一致，证明了芯片实验数据可靠。同时，我们在该扩大样本的验证中，也得到了一系列在相应组间比较中存在差异表达的基因。
　　基于上述芯片实验筛选及后续qPCR扩大样本验证中得到的差异表达基因的mRNA表达水平，我们筛选到了新的活动性结核患者及结核感染者的分子标识。ROC及决策树分析发现，CXCL10，ATP10A和TLR6三个基因表达水平的联合对于区分TB组和LTBI组的敏感性为80％，特异性为89％。在区分TB组与无结核临床症状组（LTBI&HC组）方面，我们发现CXCL10，ATP10A，TLR6，RAB20和IL2几个基因表达水平的不同的联合可以对二者进行较好的区分。CXCL10，RAB20和IL2三个基因表达水平的联合对于区分TB组和LTBI&HC组的阳性预测值最高，为90％，敏感性和特异性分别为72％和97％;另外，CXCL10，RAB20和ATP10A区分这两组的敏感性和特异性为84％和91％;CXCL10，TLR6和ATP10A三个基因联合对于区分TB组和LTBI&HC组的敏感性和特异性为68％和97％。在区分结核感染者(TB<BI组)与HC组方面，IFN-γ，CXCL10，CXCL9及IL2RA四个基因联合的效果良好，敏感性为98％，特异性为59％。
　　综上所述，通过本研究筛选出的CXCL10，ATP10A，TLR6，RAB20，IL2，IFN-γ，CXCL9及IL2RA等基因的不用组合，可用于评价结核感染者的不同疾病状态。

目录

缩略词对照表

摘要

第一章 综述

第一节 结核感染的免疫机制研究

第二节 结核感染相关分子标识研究进展

参考文献

第二章 结核感染相关获得性免疫应答差异研究

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

参考文献

第三章 结核感染相关分子标识筛选

第一节 引言

第二节 材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

参考文献

全文总结

博士期间学术成果

致谢

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