Brd2在3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中的作用及机制研究

摘要

脂肪组织主要由脂肪细胞所组成，过多的热量摄入并以甘油三酯的形式储存在白色脂肪细胞内是肥胖发生的关键。前脂肪细胞的增殖分化是成熟脂肪细胞形成的核心，从前脂肪细胞分化成成熟的脂肪细胞的过程十分复杂，特别是机体内多种细胞因子和激素在脂肪细胞发生过程中可能都有调节作用。
　　BRD2属于BET蛋白家族，在哺乳动物细胞中广泛表达，具有多种生物学功能，最新的研究表明Brd2基因突变能导致小鼠过度肥胖而不引起糖尿病，但是其作用的分子机制并不明确。在本课题中，我们观察了Brd2表达变化对前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程的影响，并且重点研究了Brd2参与的信号通路在影响前脂肪细胞向脂肪细胞分化作用的分子机制，弥补了这一部分研究的空白。
　　在研究中，我们发现Brd2表达的下调，能促使3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞的分化，甚至在无任何诱导分化剂的情况下，部分细胞也能分化成脂肪细胞;相反的，当Brd2过表达时，即使诱导分化至第8天，细胞分化也几乎完全被抑制。这就更加表明Brd2在前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中有重要的作用，同时我们认为，上述现象的产生可能是由于Brd2表达的变化影响了一些分化相关基因甚至是关键基因的表达。
　　为了研究Brd2表达的变化对脂肪细胞分化相关基因表达的影响，一方面我们利用RNA干扰技术，下调3T3-L1前脂肪细胞内Brd2的表达水平;另一方面运用将pmBrd2载体将Brd2基因导入3T3-L1前脂肪细胞，使细胞内的Brd2过表达，然后先通过RT-PCR技术检测了PPARγ和C/EBPα的时序性表达，结果表明Brd2对脂肪细胞分化的两个关键基因PPARγ和C/EBPα都有显著的负调节作用;继而运用Q-PCR技术，我们又检测了其它相关基因的表达，结果显示，422/aP2、Glut4、Leptin和Irs-1的表达都有显著的改变，而Pfkfb1的表达则没有受到明显的影响。已有研究证明PPARγ是ERK的下游分子，当ERK通路激活后，PPARγ发生磷酸化，转录活性降低从而抑制了分化，而Wang等的研究又证明了Brd2可抑制PPARγ的转录活性，由此我们首先推断Brd2可能通过ERK信号通路影响脂肪细胞的分化;其次，Glut4表达的变化直接关系到细胞的糖摄取量，而在脂肪细胞中，与糖代谢密切相关的Insulin信号通路和AMPK信号通路都可刺激GLUT4的转位，促进细胞对葡萄糖的摄取，其中Insulin信号是通过IGF-1R激活了IRS-1和IRS-2再进一步激活PI3K/Akt信号通路，最后作用于GLUT4;而在AMPK信号通路中，AICAR则可不依赖于Insulin作用而直接激活AMPK，进而刺激GLUT4的转位。在Wang等的研究中，Brd2缺失的小鼠进食量剧增，但其血糖水平并未随摄糖量的急剧增加而升高，反而与野生型小鼠相比有所下降，因此，我们认为Brd2可能通过Insulin和AMPK信号通路来共同调节脂肪细胞的糖代谢。
　　为了证实Brd2是否通过ERK信号通路影响脂肪细胞的分化，我们先利用RNA干扰技术使3T3-L1细胞内的Brd2基因沉默，然后再通过转染pmBrd2使细胞内的Brd2过表达，随后检测Brd2表达的变化对ERK、Raf和JNK的磷酸化水平的影响，结果表明ERK的磷酸化水平有明显的变化，但其上游的Raf则未受到明显的影响，同时JNK信号通路也与此过程无关;然后为了进一步确定ERK信号通路在该过程中的作用，我们观察了ERK激酶MEK1的特异性化学抑制剂U0126对此过程的影响，结果表明U0126可使Brd2过表达的细胞部分恢复分化，同时aP2的表达也得以回调。综合以上结果可证实:ERK信号通路参与了Brd2调节3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化的过程，而JNK信号通路则与之无关。
　　同样，为了证实Brd2可能通过Insulin和AMPK信号通路来共同调节脂肪细胞糖代谢，我们利用RNA干扰手段下调Brd2的表达后发现Akt的磷酸化水平明显升高，而通过PI3K的特异性化学抑制剂LY294002可使Akt升高的活性降低，相反的，当Brd2过表达时，Akt的活性则受到了抑制;同时，在研究AMPK信号通路中，我们发现Brd2具有负调节AMPK活性的作用:当Brd2表达下调时，AMPK的磷酸化水平明显升高，而通过AMPK的特异性化学抑制剂Compound C和Insulin都可降低AMPK的升高的活性，反之，当Brd2过表达时，AMPK的活性则受到了抑制;并且当Brd2基因沉默时，PI3K的特异性化学抑制剂LY294002和AMPK的特异性化学抑制Compound C都能使GLUT4蛋白表达水平显著下降。但是Brd2表达的变化对于GSK-3的活性却并不产生影响。由此，上述结果证实了我们的猜想:Brd2通过Insulin信号通路和AMPK信号通路调节3T3-L1前脂肪细胞GLUT4的表达，进而调节细胞对葡萄糖的摄取，但并不影响细胞的糖原合成。
　　综上所述，在本研究中，我们证实了Brd2在3T3-L1前脂肪细胞中参与了ERK、Akt和AMPK信号通路，调控了某些相关基因的表达，影响了前脂肪细胞向脂肪细胞的分化和糖代谢，但对ERK、Akt和AMPK信号通路中涉及的有关转录、蛋白质合成及脂代谢还需进一步的研究，最终更为详细地证实Brd2在脂肪细胞分化中的作用机制。

目录

摘要

前言

第一部分 Brd2在前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中的作用

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分 Brd2对调节前脂肪细胞分化相关基因表达的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分 Brd2通过ERK信号通路对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

第四部分 Brd2通过Insulin和AMPK信号通路对3T3-L1前脂肪细胞糖代谢的影响

材料和方法

结果

讨论

小结

全文总结和展望

参考文献

英文缩略词表

脂肪细胞的发育及调控

致谢

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