腺相关及腺病毒内耳基因转染和Rb敲除结合ISL1表达诱导小鼠毛细胞与支持细胞增殖

摘要

低等脊椎动物如鸟类、鱼类的内耳毛细胞损伤后能够终生再生，而哺乳动物耳蜗毛细胞无自发性再生能力，因此毛细胞丢失所导致的感音神经性耳聋目前仍是临床治疗中的一大难题。另外一方面，上百种基因突变引起的遗传性耳聋目前没有治疗方法。因此，研究毛细胞再生以及内耳基因导入方法的发展成为重获听觉的焦点。分子生物学研究的发展为毛细胞再生带来了希望，内耳的基因治疗和外源性基因的导入，为耳聋的治疗带来了新的手段。腺病毒及腺相关病毒是内耳基因治疗常见的载体。为了验证合适的基因治疗的载体，我们使用新近发展的纳升级显微操作导入系统，大范围的在体研究了12种不同血清型的AAV作为基因载体导入的可行性，我们发现在新生鼠和成年鼠中，不同血清型的AAV可以转染不同的内耳感觉上皮细胞，包括支持细胞和毛细胞。我们还发现在新生鼠(P1/P2)给予内耳注射AAV可以持续表达较长时间，而对听力的影响很小(0-15dB)。这种方法可以用来作为早期内耳发育过程中基因功能缺失所致的遗传性耳聋的基因治疗手段。
　　 在胚胎期的内耳毛细胞及支持细胞的前体细胞中选择性敲除Rb1可产生数量远超出正常情况的前体细胞，这些细胞可进一步分化成毛细胞和支持细胞。但Rb1敲除后诱导毛细胞和支持细胞增殖是年龄相关性的，其具体引起增殖的时间截点如何?即Rb1敲除对不同年龄段内耳感觉上皮细胞重新进入细胞周期的功能如何?是否可以结合其他内耳前体细胞基因可以让更成熟甚至成年的哺乳动物毛细胞、支持细胞增殖?本研究拟行5型腺病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的评价；以Er-Cre Rb loxp/loxp系统结合腺病毒为载体携带Cre来敲除Rb1并过表达内耳前体细胞基因ISL1诱导新生及成年小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞的增殖的研究。
　　 第一部分：5型腺病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的评价
　　 [目的]为了研究5型腺病毒携带目的基因经新生和成年小鼠中阶入路导入转染内耳细胞的可行性，为以小鼠为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。
　　 [方法]采用纳升级显微操作系统，经中阶显微注射携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)基因的5型重组腺病毒或人工内淋巴液于各年龄段的小鼠耳蜗(p1，p4，p7，p12，p21，1-2M)，内耳注射4天后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片，观察EGFP表达情况。
　　 [结果]p1、P4、P7组：术后第4天见耳蜗底圈、中圈支持细胞表达GFP。p12、p21、1-2M组：术后第4天可见耳蜗底圈、中圈支持细胞及部分内毛细胞表达EGFP。在人工内淋巴液和未注射耳，未见EGFP表达。
　　 [结论]采用经中阶入路显微注射5型腺病毒携带目的基因导入新生鼠及成年鼠能够将目的基因成功转染至耳蜗组织并表达。
　　 第二部分：12种腺相关病毒经中阶路径注射转染新生和成年小鼠耳蜗毛细胞和支持细胞的比较
　　 [目的]为了比较12种腺相关病毒携带目的基因经新生和成年小鼠中阶入路导入内耳的可行性，寻找新的更安全的载体，为以小鼠为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。
　　 [方法]采用经中阶显微注射12种腺相关病毒((AAV1、2、5、6、6.2、7、8、9、rh8、rh10、rh39、rh43))携带目的基因导入，将携带EGFP的腺相关病毒或人工内淋巴液导入小鼠耳蜗。其中新生鼠为p1/p2 CD1小鼠，成年鼠为CBA/CAJ。新生鼠在内耳注射后1周、2周、3月，成年鼠在1周及3月后分别取双侧耳蜗标本做基底膜铺片及冰冻切片，观察EGFP表达情况。部分新生鼠组在术后3周行ABR检测。
　　 [结果]新生鼠组：术后第1周、2周、3月可见支持细胞、毛细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、前庭感觉细胞表达EGFP，GFP在术后1周表达较弱。术后ABR示听力约有0-15dB下降。其中AAV1和AAV2对支持细胞和毛细胞的感染效率相对较高。成年鼠组：术后1周、3月可见支持细胞、毛细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、前庭感觉细胞表达EGFP。其中AAV1、AAV8和AAV9对支持细胞和毛细胞的感染效率相对较高。
　　 [结论]采用经中阶显微注射腺相关病毒携带目的基因导入新生鼠及成年鼠能够将目的基因成功转染至耳蜗组织并表达，其中新生鼠组只有轻微的听力下降。新生鼠组可选择AAV1和AAV2作为载体，成年鼠组可选择AAV1、AAV8和AAV9。
　　 第三部分：敲除Rb1并过表达ISL1诱导小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞增殖的体内研究
　　 [目的]在体敲除Rb1并过表达ISL1诱导小鼠耳蜗毛细胞与支持细胞增殖的研究。
　　 [方法]采用Er-Cre Rb loxp/loxp转基因鼠，体内模型中敲除Rbl基因，研究其对耳蜗毛细胞及支持细胞增殖的促进作用。以Er-Cre Rb loxp/loxp转基因鼠与ISL1转基因鼠杂交，获得Er-Cre Rb loxp/loxp ISL1或Rb loxp/loxp ISL1转基因鼠，在体敲除Rb1并过表达ISL-1，研究其对P1、P4、P5、P7、P12及P21耳蜗毛细胞及支持细胞增殖的促进作用。
　　 [结果]在出生后的耳蜗毛细胞中特异性敲除Rb1基因，可见毛细胞和支持细胞在P4前能重新进入细胞周期，P5、P7、P12及P21未见毛细胞和支持细胞增殖。ISL1过表达在新生鼠和成年鼠中均未见毛细胞和支持细胞增殖，Rb1敲除联合ISL1过表达，也未见P4之后的毛细胞和支持细胞增殖。
　　 [结论]Rb1基因敲除诱导耳蜗毛细胞和支持细胞增殖呈年龄相关性，Rb1敲除联合ISL1过表达也未能使得P4之后的毛细胞和支持细胞增殖。