丹参酮ⅡA通过促血管正常化抑制肝癌姑息性切除术后转移增强及延长生存期

摘要

原发性肝癌(主要指肝细胞癌，简称肝癌)是世界第三位、我国第二位癌症死亡原因。手术切除仍是早期肝癌的首选治疗策略，然而由于肝癌的多灶性及早期血管侵犯等特性，术后5年的复发或转移风险仍然高达70％。尽管针对复发瘤可二次切除，但大多数患者已无手术机会。对于远处转移的患者，常规治疗手段大都无效。复发转移已成为肝癌患者的主要死因，即使早期肝癌也可有较高转移潜能，肿瘤生长与转移可同时进行。
　　 由于影像学未能发现的微卫星灶及微血管侵犯的存在，大部分肝癌“根治性切除”手术实质上属于姑息性切除。原发瘤一旦被切除，残余癌细胞及术前已播散的异位癌细胞可能获得或增强转移潜能，形成复发、转移灶或转移至新的组织器官。姑息性手术所造成的系列影响可能是术后复发转移的主要原因。因此研究姑息性切除对残余肝癌侵袭转移潜能的影响及其干预具有重要临床意义。
　　 姑息性切除术后血管旺生，但往往幼稚且结构不完整，造成残癌缺氧加重。一方面缺氧的残癌细胞侵袭转移潜能增强，另一方面结构异常的新生血管更有利于残癌细胞侵出血管及在转移靶器官定植，最终导致复发转移。因此，具潜在促血管正常化的药物可能抑制肿瘤转移。
　　 丹参酮Ⅱ A是从中药丹参提取的活性单体成分，常用于心脑血管疾病患者，亦常用于肝炎患者，具有活血化瘀、改善微循环的作用。我组既往研究发现含丹参的五味中药“松友饮”可抑制姑息性切除术后肝癌转移，然其机制未明。我们认为其活血化瘀作用可能包含促血管正常化作用。
　　 本课题首先选用高转移潜能人肝癌MHCC97H细胞系，建立单肝叶双瘤原接种的肝癌姑息性切除术后裸鼠残癌模型。再应用高转移潜能人肝癌HCCLM3和低转移潜能HepG2裸鼠模型，验证术后残癌侵袭转移潜能变化，结果表明肝癌姑息性切除术后残癌生长和转移显著增强。随之我们将丹参酮Ⅱ A直接用于单瘤原原位接种模型，发现它不能抑制移植瘤生长但可减少转移、显著延长荷瘤裸鼠生存期。在此基础上，我们进一步将它用于残癌模型，观察它对残癌侵袭转移的影响及主要作用机制。最后结合临床实际，我们将丹参酮ⅠA与干扰素α联用，观察它是否能减低后者的给药剂量及缩短其给药时间。
　　 1.肝癌姑息性切除术后裸鼠残癌模型的建立
　　 采用单肝叶双瘤原原位接种技术建立MHCC97H裸鼠原位移植瘤模型，行姑息性切除术(PR)切除1瘤，观察5周。结果表明双瘤模型的双瘤成瘤率95.6％、PR成功率95.3％(手术死亡率4.7％)、裸鼠总体存活率90.2％，与单瘤原接种后行PR比较具有显著优势，后者的成瘤率100％、手术死亡率73.3％、总体存活率20％。成功建立姑息性切除术后的裸鼠残癌模型。
　　 2.肝癌姑息性切除术后残癌转移显著增强
　　 姑息性切除术(PR)组的平均肿瘤体积大于假手术(Sham)组(P<0.05)。与Sham组比较，PR组的肺转移(仅HCCLM3)显著增加(110.11±28.01vs7.22±4.71，P<0.001)、肝内播散和腹腔转移亦显著增加(P<0.05)，术后2天和35天的循环血肿瘤细胞比例也均显著增加(P<0.001)。
　　 3.丹参酮ⅡA不能直接抑制移植瘤生长，但可减少转移，延长荷瘤裸鼠生存期
　　 在单瘤给药模型，生理盐水、TanⅡA1，5，10 mg/kg/day四组的肿瘤大小无差别。与生理盐水组比较，TanⅡA5和10 mg/kg/day组的肺转移显著减少(P=0.046和P<0.001)、肝内播散率和腹腔转移也显著降低(P<0.05)、生存期(见下)显著延长(P<0.05)。分别与TanⅡA1和5 mg/kg/day组比较，10 mg/kg/day组的肺转移也显著减少(P=0.003和P=0.046)。HepG2未发现腹腔转移。TanⅡA10 mg/kg/day的抑制效果最强，因而被选用于后续实验。
　　 4.丹参酮ⅡA显著抑制肝癌姑息性切除术后残癌转移，延长裸鼠生存期
　　 PR后TanⅡA10 mg/kg/day给药组残癌体积较给生理盐水组缩小，差异有统计学意义(P<0.05)。与PR后给生理盐水组比较，TanⅡA给药组肺转移(仅HCCLM3)显著减少(13.56±11.33 vs94.56±31.47，P<0.001)、肝内播散和腹腔转移亦减少(P<0.01)、循环血肿瘤细胞比例(以肿瘤体积标准化后)则相对降低(P<0.001)。最重要的是，给药过程中发现TanⅡA可显著延迟荷残癌裸鼠体重的下降；前述发现PR组裸鼠生存期显著短于Sham组(P<0.01)；在单瘤给药模型，TanⅡA较生理盐水组可显著延长荷瘤裸鼠生存期HCCLM3高达16天(P=0.004)及HepG2高达19天(P<0.001)；在双瘤给药模型，TanⅡA还可使PR后缩短的生存期再显著延长(HCCLM3:47.833±3.280 vs69.000±1.693；HepG2:52.167±2.496 vs79.667±2.940，均P=0.001)。
　　 5.丹参酮ⅡA不能抑制肝癌细胞增殖，但可降低其侵袭运动能力
　　 与0.1％DMSO(TanⅡA溶剂)对照组比较，TanⅡA0.01-100μmol/L(μM)各梯度浓度组的光吸收值(OD值，代表细胞增殖密度)均无显著变化；TanⅡA5和10μM组侵袭的细胞数均显著减少(均P<0.01)，而TanⅡA1μM组不减少，差异无统计学意义。
　　 6.丹参酮ⅡA显著改善残癌缺氧，却并不能下调体外肝癌细胞缺氧模型的HIF-1α表达
　　 PR后残癌Pimonidazole和HIF-1α均显著增加，与该变化一致，残癌上皮-间质转化(EMT)显著增强(N-cadherin和Vimentin上调，E-cadherin下调)；PR后给予TanⅡA使两者均降低，同时残癌EMT被逆转；表明PR显著促进残癌缺氧并诱导残癌细胞EMT变化，TanⅡA在体给药可减轻残癌缺氧同时抑制EMT。体外肝癌细胞低氧培养发现HIF-1α、N-cadherin、Vimentin均上调、E-cadherin下调，然而加入TanⅡA干预发现，除E-cadherin被上调外，其余3个分子并未如预期结果被下调。进一步检测发现TanⅡA确可直接上调肿瘤细胞E-cadherin。整个实验中各分子的mRNA和蛋白表达变化基本一致。
　　 7.丹参酮ⅡA不改变残癌微血管密度(MVD)，但显著增加微血管完整度(MVI)
　　 鼠MVD以CD31为标记，NG2是血管周细胞的主要分子标记，在本研究用于评估MVI。PR组平均CD31密度高于Sham组(P<0.001)，而PR后给TanⅡA和生理盐水两组间CD31无差异。与Sham组比较，PR后NG2表达无改变，而PR后给TanⅡA组NG2水平显著升高(P<0.01)。连续切片免疫组化CD31、NG2、Pimonidazole染色发现，PR后给生理盐水组残癌CD31高、NG2低、缺氧严重(Pimonidazole染色面积大)；而PR后给TanⅡA组CD31高、NG2也高、因而缺氧较轻；表明PR后残癌MVD增加、但MVI却较低下，TanⅡA虽不能抑制MVD(血管生成)、但显著增加MVI促进肿瘤血管完整。肿瘤血管扫描电镜可直接观察到TanⅡA组血管壁完整性明显高于生理盐水组。免疫荧光双标结果进一步证实TanⅡA不改变CD31、但上调NG2，因而降低残癌缺氧。
　　 8.丹参酮ⅡA显著增强内皮细胞(HUVECs、人和鼠TECs)体外成管能力，与上调VEGFR1和PDGFR表达密切相关
　　 体外常氧和低氧培养的HUVECs和人TECs的成管能力在加TanⅡA干预时均显著增强。从PR后TanⅡA(in vivo)给药组分选的TECs，其成管能力明显强于从PR组分选的TECs。应用PR组TECs，结果发现其成管能力亦可被体外加TanⅡA(in vitro)干预显著增强，且与TanⅡA(in vivo)给药组大致相当。流式细胞术分析发现TanⅡA(in vivo)给药组TECs表面VEGFR1和PDGFR表达阳性细胞比例以及两者的相对荧光强度均显著高于PR(生理盐水)组(P<0.05)，而两组间VEGFR2、EGFR、FGFR1均无差异。应用VEGFR1/PDGFR选择性抑制剂SU6668，结果进一步表明，TanⅡA体内外干预增强TECs成管的能力被显著削弱，而在无TanⅡA干预时SU6668的抑成管作用并不明显。
　　 9.丹参酮ⅡA与干扰素α联用，可使后者给药剂量减少三分之一
　　 基于TanⅡA的上述发现，我们继续比较PR后应用大剂量IFN-α(1.5×107U/kg/day)与联用IFN-α剂量减低三分之一(1.0×107 U/kg)隔日给药加TanⅡA(10 mg/kg/day)两种给药方式间疗效的差别。结果发现，IFN-α单用组和联用组的平均肿瘤体积分别为0.391±0.411 cm3和0.756±0.349 cm3，两组间差异无统计学意义(P=0.282)，且均小于生理盐水组的3.160±0.405 cm3(P<0.001)；IFN-α单用组和联用组的平均肺转移灶个数分别为12.83±6.85和1.50±2.51，联用组少于单用组(P=0.001)，且均少于生理盐水组的29.33±6.95(P<0.001)；表明两组间抑瘤效果无差异，IFN-α剂量减低三分之一隔日给药与TanⅡA联用抑转移作用强于大剂量IFN-α单用。
　　 结论：
　　 1.丹参酮Ⅱ A通过促进VEGFR1/PDGFR上调相关的肿瘤血管正常化抑制肝癌姑息性切除术后残癌转移的增强，并延长荷残癌裸鼠生存期。
　　 2.丹参酮Ⅱ A与干扰素α联用，可使后者给药剂量减低三分之一，而达大剂量干扰素α相当的疗效。
　　 创新点：
　　 1.首次发现丹参酮Ⅱ A可显著抑制肝癌姑息性切除术后残癌转移的增强、并延长生存期，其机制主要通过促进VEGFR1/PDGFR上调相关的肿瘤血管正常化来实现。
　　 2.创建单肝叶双瘤原的原位接种再行姑息性切除术的裸鼠残癌模型。
　　 临床应用前景和科学意义：
　　 1.本实验发现丹参酮ⅡA通过“血管正常化”抑制肝癌切除后转移并延长生存期，将为临床提供简单易行副反应小的预防转移复发的辅助疗法，并可减少干扰素用量使病人耐受较长期用药。
　　 2.本研究提示通过血管正常化的“疏导”策略，可改善残癌缺氧，并部分逆转癌细胞的恶性表型，是抗癌战中“消灭肿瘤”策略的重要补充，从而达到提高疗效。
　　 3.本研究所用裸鼠丹参酮ⅡA最显效剂量10 mg/kg/day折算成人体使用剂量为1.11 mg/kg/day，在临床参考用量范围0.67-1.33 mg/kg/day内，适合用于临床。