利用HRM技术对CYP2C19基因进行双重SNP分型和TALEN介导的小鼠p53基因敲除

摘要

第一部分应用HRM技术对CYP2C19*2和CYP2C19*3进行双重SNP分型
　　氯吡格雷是一种广泛用于预防静脉血栓形成的抗血小板药物。研究表明，携带有CYP2C19基因功能缺失型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3的病人，其体内代谢氯吡格雷成为其活性形式的能力降低，导致氯吡格雷抑制血小板聚集功能减弱。本研究旨在建立一种利用高分辨率熔解曲线分析(high-resolutionmelting curve analysis，HRM)技术在闭合单管中同时对CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点进行简便、准确分型的方法。本实验针对两个SNP位点分别设计特异性的HRM引物，并在两个位点引物的5'端分别加上富含AT和GC的序列，保证两个位点的扩增产物熔解峰无重叠。利用HRM技术，我们快速、灵敏的对64例随机DNA样本的CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点进行了基因分型，且HRM方法的分型结果与测序验证结果完全一致。因此，利用HRM技术可以实现在闭合单管中简便、准确地对CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点同时进行基因分型。该方法有望应用于临床，指导氯吡格雷的个体化用药。
　　第二部分TALEN介导的小鼠p53基因修饰
　　TALEN是由植物病原菌——黄单胞菌的转录激活因子样效应物（transcription activator-like effectors TALE）蛋白的DNA结合结构域和FokI核酸酶的DNA非特异性切割结构域构成的内切核酸酶。TALEN可以特异性识别并切割DNA序列，引起DNA双链断裂，从而引发非同源末端连接和同源重组，目前广泛应用于基因定点修饰和定点突变。本课题旨在利用TALEN技术，实现对小鼠细胞p53基因进行定点修饰。我们设计了针对小鼠p53基因序列的特异性酵母系统TALEN表达载体PTAL3-TALEN F、PTAL3-TALEN R，哺乳动物细胞TALEN表达载体pcDNA3.1-TALENF、pcDNA3.1-TALENR，酵母系统中TALEN切割效率检测质粒pGBKT7-TAL site和同时带有GFP荧光标记和嘌呤霉素抗性基因的p53基因打靶载体p53-TV。将PTAL3-TALEN F、PTAL3-TALEN R、pGBKT7-TAL site质粒同时转化酵母细胞，对TALEN的切割效率进行检测，得到TALEN的切割效率约为3.5％。将pcDNA3.1-TALENF、pcDNA3.1-TALENR共转染NIH3T3细胞，并利用HRM技术成功检测到基因突变。将pcDNA3.1-TALENF、pcDNA3.1-TALENR、p53-TV质粒共NIH3T3细胞，转染后48小时，观察重组后细胞的GFP表达状况，并加入终浓度8μg/ml的嘌呤霉素的筛选重组细胞。筛选后重组细胞扩大培养，进行PCR鉴定和细胞周期检测。我们获得了同时具有嘌呤霉素抗性和表达GFP的细胞，且细胞形态差异较大，存在多核细胞。PCR鉴定和基因测序结果表明，断裂的p53基因与供体DNA发生位点特异性重组。细胞周期检测结果表明，p53基因重组后表达受到抑制，引起细胞周期阻滞。因此，TALEN技术可以应用于活体细胞的基因修饰，为后续遗传性疾病的基因治疗和基因突变育种提供理论和技术依据。

目录

摘要

缩略词

第—部分 应用HRM技术对CYP2C19*2和CYP2C19*3进行双重SNP分型

材料和方法

结果

讨论

第二部分 TALEN介导的小鼠p53基因敲除

第一节：TALEN载体构建

材料和方法

结果

第二节：酵母系统验证TALEN切割效率

材料和方法

结果

第三节 HRM检测哺乳动物细胞中TALEN切割作用

材料和方法

结果

第四节：TALEN介导小鼠p53基因定点突变

材料和方法

结果

讨论

综述 小鼠基因突变方法研究进展

参考文献

致谢

在读期间论文发表情况和获奖情况

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