利用TALEN技术构建UrotensinⅡ基因敲除小鼠模型

摘要

【背景与目的】：尾加压素II（Urotensin II，UII）是迄今为止哺乳动物体内发现的最强的缩血管物质，主要分布于心血管和神经组织；G蛋白偶联受体GPR14是其特异性受体，也主要分布于心血管和神经系统，UII可通过与 GPR14结合引起细胞内 Ca2+浓度增加，参与许多生物学效应，如收缩血管、收缩气道、促进细胞增殖、促进基质表达及细胞迁移等。在心血管系统中，参与血压调节、心肌缺血、心肌收缩、心肌重构及血管平滑肌细胞增殖等，在冠心病、高血压、糖尿病心肌病等发病过程中起着重要作用。在既往UII相关研究中，学者们利用外源性药物干预、UII转基因构建动物模型等干预方式进行了一系列研究，而随着UII相关研究的深入，利用基因敲除技术构建UII基因敲除模型则是不可避免的、重要的研究手段，将有利于深入探讨UII的生理和病理生理意义，有助于探讨心血管疾病发生的新机制和治疗的新方法。
　　类转录激活因子效应物核酸酶（transcriprtion activator-like effctor nuclease，TALEN）介导的基因靶向修饰技术是目前应用较广泛的成熟的基因敲除技术，它主要包含有两个重要的结构域：特异性识别核酸的靶点识别区域和切断 DNA序列的核酸酶功能结构域。本研究利用TALEN技术人工构建针对外显子的重组核酸酶TALEN，在体内对特定位点产生DNA双链断裂，利用细胞自身DNA损伤后的非同源末端链接（non-homologous end joining, NHEJ）引入基因突变、敲除以达到目的基因UII失活的效果，从而实现基因定点修饰的目的，并建立C57BL/6J小鼠UII基因敲除的动物模型。
　　【方法】：采用生物信息学方法，分析C57BL/6J小鼠UII基因的编码序列，在线设计UII敲除位点并针对外显子设计靶点。利用模块组装法克隆，构建特异性 TALE靶点结合域，进行组装TALEN模块，得到左右臂完整的TALEN质粒，经菌液PCR及双酶切验证质粒活性。提取TALEN质粒并转染Hepa细胞，经提取DNA、PCR电泳、酶切鉴定TALEN打靶质粒剪切活性。酶切TALEN打靶载体使其线性化，体外转录成mRNAs。利用显微注射的方式注入到C57BL/6J小鼠受精卵中，并移植到受体雌鼠。取出生2周龄小鼠尾巴对其进行PCR鉴定、酶切鉴定、构建TA克隆测序确认突变体的基因型，筛选出UII基因敲除的C57BL/6J小鼠。将F0代阳性小鼠繁殖得到纯合UII基因敲除小鼠后代。
　　【结果】：在UII基因的外显子上设计了TALEN识别剪切位点，经菌液PCR、双酶切证实成功构建出了具有活性的 TALEN质粒，并在细胞水平验证其具有剪切活性，注射mRNA到C57BL/6J小鼠受精卵获得了20只敲除小鼠，其中6只小鼠UII发生移码突变，测序显示小鼠突变体产生了不同片段大小、不同位置的UII基因敲除。
　　【结论】：成功构建制备了C57BL/6J小鼠UII基因敲除小鼠模型，为进一步采用该动物模型探究UII参与心血管疾病的致病机制及治疗研究奠定了基础。

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第一章 前言

第二章 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法与步骤

第三章 实验结果

3.1 UII基因的敲除位点的设计

3.2构建TALEN载体

3.3细胞层面验证TALEN质粒打靶活性

3.4 TALEN体外转录mRNA

3.5 显微注射获得F0代小鼠

3.6挑选阳性突变体及分析基因型

3.7 纯合UII敲除小鼠

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述: 制备动物模型的常用基因编辑技术的研究进展

已发表及撰写的文章

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