利用TALENs和手工克隆技术高效获得GHR基因敲除巴马猪

摘要

DNA编辑技术是基因靶向修饰技术的研究热点,已广泛应用于生物医学和农业研究.然而,传统基因打靶技术存在效率低、成本高、工作量大等缺点,其应用受到了极大的限制.文章利用最近发展起来的新型人工核酸酶——转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALENs)介导的基因组定点修饰技术,通过构建特异识别猪生长激素受体(GHR)基因的TALENs表达载体,共转染巴马胎猪成纤维细胞系,酶切鉴定G418抗性克隆细胞株的基因修饰效率为46.2％,其中2个为双等位基因敲除的克隆细胞株.以双等位基因敲除的克隆细胞株为核供体,利用手工克隆技术制备GHR-KO巴马猪克隆胚,第6d囊胚率为43.5％,654枚体外发育的囊胚移植6头受体母猪,共获得10头存活的GHR-KO巴马仔猪,其中7头为双等位基因敲除.体重检测结果显示,第20周龄的GHR-KO巴马猪体重仅为对照巴马猪的50％.研究结果表明,TALENs和手工克隆技术能够高效制备出基因敲除大动物.GHR-KO巴马猪的成功制备为研究猪GHR基因生理功能以及人类侏儒症分子机理提供了重要模型,也证明该技术比传统基因打靶和克隆技术具备更简捷、快速、高效,更易于在生物医学和农业基因靶向修饰研究中推广.