毛细管电泳对支链氨基酸分离检测方法的研究及应用

摘要

支链氨基酸（BCAAs）是一类能够促进人体肌肉合成和缓解疲劳，提高免疫力的重要氨基酸，是运动营养补剂中关键的功效成份，定量分析运动营养补剂中以及运动员尿样中BCAAs的含量不仅能够达到对运动营养补剂的质量监控和功效评价的目的，并且还能通过运动员BCAAs摄入量和排泄量的关系来为运动员营养补剂使用方案的开发提供数据支持。另外，人体尿样中BCAAs浓度的升高还是一些疾病的生物标志（如枫糖尿病）。在众多的氨基酸拆分方法中，毛细管电泳（CE）技术因其分析速度快、分离能力强、试剂消耗少等优点而被广大研究者广泛应用。紫外（UV）检测器拥有价格低廉，应用广泛的优势。本课题旨在开发简便的BCAAs的CE-UV分析方法以期应用于上述方面。
　　第一章中主要介绍了CE系统的构造与基本原理，并重点阐述了BCAAs补充对运动员的重要作用和过度补充BCAAs（或蛋白质类运动营养补剂）对人体的危害以及BCAAs需求量和最大可耐受摄入量的测定方法。提出了CE应用于BCAAs分析以及运动员营养补剂使用方案开发的良好前景。
　　第二章主要对六种背景吸光电解质的紫外吸收性质以及与几种重要氨基酸的电泳淌度进行了考察与比对，并结合这六种电解质的稳定性，最终选择了适用于BCAAs间接紫外检测的背景电解质对氨基水杨酸（PAS）。通过添加EDTA，亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile）能够实现部分分离，但L-Ile的色谱峰却始终与Leu重叠，无法通过EDTA的添加实现分离。因此，后续的工作重点在于选择合适的背景添加剂使Leu和Ile完全分离。
　　第三章是BCAAs的CE-间接紫外检测方法的开发。通过对pH值、背景添加剂浓度以及背景紫外吸光电解质浓度等影响条件的优化以及影响机理的讨论，最终确定了最优分离条件为2.0 mM Na2HPO4，10.0 mM PAS，40.0 mMβ-环糊精（β-CD），pH=12.2。在此条件下，Leu和L-Ile的分离度为1.0（样品浓度均为0.5 mM），方法的重现性良好（峰面积的RSD<2.1％，n=5），灵敏度虽低于荧光、质谱等检测器，但本章中BCAAs的分析方法可以避免繁杂的柱前衍生过程，并且价格低廉，可应用范围广。
　　第四章是基于BCAAs在较低的紫外波长下（<220 nm）有一定的紫外吸收的原理，开发了BCAAs低波长直接紫外检测方法，在40.0 mM硼砂，40.0 mMβ-CD，pH=10.2的条件下，BCAAs能够得到完全分离。方法的背景电解质组成更加简单，同时检测的灵敏度也要高于文献报道的相似工作。
　　第五章是间接检测法和直接检测法在运动营养补剂以及运动员尿液中BCAAs分析中的应用。间接检测法获得的补剂中BCAAs含量的数据与文献报道接近，而直接检测法中L-Ile峰则受到了干扰。而运动员尿样中未能检测出BCAAs，原因一方面可能是灵敏度不足，另一方面可能是因为运动员补充的BCAAs未达到可耐受摄入量。本章最后提出了BCAAs萃取的标准方法，有望解决以上所述的问题。

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第一章 绪论

1.1 毛细管电泳概述

1.2 支链氨基酸与运动营养的关系

1.3 支链氨基酸需求量及可耐受摄入量的测定

1.4 毛细管电泳在支链氨基酸可耐受摄入量测定中的应用前景

第二章 背景吸光电解质性质考察及支链氨基酸的分离初探

2.1 引言

2.2 实验仪器、试剂和方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

第三章 毛细管电泳分离-间接紫外检测支链氨基酸

3.1 前言

3.2 实验仪器、药品与方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 毛细管电泳低波长紫外检测支链氨基酸

4.1 前言

4.2 实验仪器、药品与方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第五章 营养补剂和尿样中支链氨基酸的分析及前处理方法研究

5.1 前言

5.2 实验仪器、药品与方法

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

参考文献

附录一

附录二

硕士期间发表的论文

致谢