促性腺激素释放激素激动剂对耐药卵巢癌细胞的作用研究

摘要

上皮性卵巢癌（epitheliAlovarian cancer，EOC）是严重威胁妇女健康的疾病，发病率在妇科恶性肿瘤中已上升至第二位，死亡率居于第一。
　　 大约70％的卵巢癌患者为Ⅲ期或Ⅳ期病变。肿瘤细胞减灭术+铂类为基础的联合化疗是卵巢癌公认的最佳初治方案，但大约70％～80％达到完全缓解的患者在首次治疗2年内出现肿瘤复发，并且治愈的可能性很小。尽管应用了补救性化疗治疗复发，但是这并不能使总的无瘤生存期和总的生存率延长。复发性卵巢癌患者的预后仍然很差，5年生存率仅为23％，而Ⅲ期和Ⅳ期卵巢癌患者只有14％。主要是因为卵巢癌对化疗药物产生了耐药性。因此对于卵巢癌，尤其是化疗耐药卵巢癌的治疗成为了改善肿瘤预后、提高患者生存率的最关键性因素。
　　 流行病学研究显示，甾体激素在卵巢癌的发生发展中起一定的作用，促性腺激素、雌激素、雄激素可能是致病因子，而促性腺激素释放激素和孕酮可能是保护因子。实验研究显示，有些激素的受体在卵巢癌细胞中表达，并介导激素对细胞的生长刺激和生长抑制效应，包括促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）受体、黄体生成素（1uteinizing hormone，LH)受体、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)受体、雌激素受体、孕激素受体和雄激素受体等。这为开展卵巢癌的内分泌治疗提供了可能。内分泌治疗激素依赖性肿瘤现已广泛用于临床，具有给药方便，毒副作用小，不良反应少，疗效持久等优点，对于乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌等，内分泌治疗常作为首选的治疗手段。
　　 在内分泌治疗的药物中，尤以GnRH 类似物的应用备受关注，其在上述肿瘤的治疗中均取得了良好的临床疗效。
　　 GnRH为下丘脑分泌的十肽激素，是下丘脑-垂体-性腺轴的关键信号分子，能与垂体前叶促性腺细胞的GnRH 受体特异性结合，调节垂体LH、FSH的合成和分泌。LH、FSH 释放进入血循环，作用于性腺，调节生殖细胞成熟及性激素合成分泌。“促性腺激素假说”是关于性激素在卵巢癌发病机制中的作用的第一个假说。它推测卵巢癌的发生是LH、FSH对卵巢组织过度刺激的结果。体外研究显示，促性腺激素可能通过FSH 受体和/或LH 受体的介导，诱导上皮生长因子受体（epidermAlgrowth factorreceptor，EGFR）和血管内皮生长因子（vascular endotheliAlgrowth factor，VEGF）表达刺激卵巢表面上皮细胞（ovarian surface epithelium，OSE）的增殖，而这些因子对卵巢癌的发生发展起作用。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活也参与FSH在肿瘤发生前和肿瘤性的OSE细胞的生长刺激效应。
　　 多数有关GnRH 激动剂的临床试验[ 曲普瑞林（Triptorelin）、亮丙瑞林（Leuprolide）、戈舍瑞林（Goserelin）]是在至少对一种化疗方案无效的难治性或复发性卵巢癌患者中进行的。目前的结论是GnRH 激动剂可能对复发性卵巢癌患者提供了一种中等有效的补救治疗，甚至在一些病例中可能实现长期持续的疾病稳定。由于应用GnRH 激动剂治疗没有明显的副作用，因此，对于不能耐受或接受化疗的患者来说仍然是一种有效的选择。有关GnRH 激动剂的实验室研究，尤其是对耐药卵巢癌细胞作用的观察及可能机制的探索，目前国内外尚少见相关报道。
　　 本课题首先在体外诱导筛选出对顺铂耐药的卵巢癌细胞亚系，并观察了耐药细胞与亲本细胞之间的生物学特性差异。实验结果显示，伴随卵巢癌细胞对顺铂耐药性的增加，细胞增殖速度减慢，而抗失巢凋亡和侵袭转移能力增加。随后，课题重点观察了GnRH 激动剂对耐药卵巢癌的作用并探索其可能的机制。研究结果显示，GnRH 激动剂可以抑制耐药卵巢癌细胞的增殖，可与顺铂协同增加顺铂对耐药细胞的毒性，起到化疗增敏作用；而且，GnRH 激动剂还能够抑制耐药卵巢癌细胞的侵袭和转移。
　　 GnRH 激动剂协同顺铂抗耐药卵巢癌细胞的增殖效果在裸鼠体内试验中也得到了的验证。以上结果可能的机制为GnRH 激动剂能够抑制EGFR-MAPK-ERK1/2信号通路的激活，并下调由EGF 引起基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的高表达（主要是MMP-2和MMP-9），以及上调金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor ofmetalloproteinases，TIMPs）的表达（主要是TIMP-2和TIMP-1）有关。促性腺激素释放激素激动剂，卵巢癌，化疗耐药，化疗增敏，侵袭，转移，表皮生长因子受体，细胞外信号调节激酶1/2，MMPs，TIMPs第一部分人类卵巢癌耐药细胞亚系的诱导及其裸鼠皮下荷瘤模型的建立目的：体外诱导筛选人卵巢癌顺铂（Cisplatin，CDDP）耐药细胞亚系，并继而建立耐药细胞的裸鼠皮下荷瘤模型。
　　 方法：采用逐步递增顺铂浓度、间歇作用的方法，体外诱导建立卵巢癌OVCAR-3 耐药细胞亚系。取对数生长期的亲本和耐药卵巢癌细胞，MTT法测定细胞的IC50和耐药指数；双层软琼脂集落隆形成实验观察细胞的恶性增殖能力；流式细胞仪技术测定细胞周期的变化和抗失巢凋亡的情况；Transwell小室观察细胞的体外侵袭和转移能力。裸鼠皮下接种耐药卵巢癌细胞建立动物荷瘤模型。
　　 结论：与OVCAR-3细胞相比，顺铂耐药的OVCAR-3/CDDP细胞增殖能力减弱，但抗失巢凋亡能力和侵袭转移能力均增强。
　　 第二部分GnRH 激动剂通过EGFR-MAPK-ERK1/2信号通路对人耐药卵巢癌细胞化疗敏感性的影响
　　 目的：观察GnRH 激动剂 [D-Trp 6] GnRH-I (Triptorelin）对耐药卵巢癌细胞的增殖、细胞周期和细胞凋亡及耐药逆转的作用，并探讨其可能机制。
　　 方法：设计Triptorelin、CDDP 单药及两者联合药物作用的不同情况下：MTT 法观察耐药细胞的增殖抑制情况及计算耐药逆转倍数；流式细胞术评价联合用药对耐药细胞周期和细胞凋亡的作用；免疫印迹法（Westernblot）检测ERK1/2信号通路在Triptorelin 增敏顺铂细胞毒作用过程中的改变；流式免疫荧光法测定卵巢癌细胞表面EGFR的变化情况；药物作用于耐药细胞裸鼠皮下荷瘤模型，免疫组化法检测移植瘤中EGFR蛋白表达。
　　 结论：体内、体外实验结果均提示，Triptorelin 可抑制卵巢癌耐药细胞的增殖，与CDDP 联合应用可增加耐药细胞周期中G0/G1期细胞的比例，减少S 期细胞比例，并能诱导耐药细胞的凋亡。Triptorelin能够协同顺铂增敏耐药细胞的化疗敏感性，此种作用可能与其下调细胞EGFR的表达及抑制ERK1/2的活性有关。
　　 第三部分促性腺激素释放激素激动剂通过下调EGF 诱导的MMP-2、MMP-9 高表达而抑制人耐药卵巢癌细胞的侵袭和转移目的：观察GnRH 激动剂Triptorelin对耐药卵巢癌细胞体外侵袭和转移的作用，并探讨其可能的分子机制。
　　 方法：Transwell小室侵袭和迁移实验观察EGF、AG1478和Triptorelin不同处理情况下，人耐药卵巢癌OVCAR-3/CDDP细胞的侵袭和转移能力的变化情况；ELISA 法检测不同药物处理组MMP-2，MMP-9，TIMP-1，TIMP-2的蛋白表达量情况；Western blot蛋白免疫印记法检测EGF，AG1478和Triptorelin对耐药细胞P-EGFR蛋白表达的影响。
　　 结论：Triptorelin能够抑制人卵巢癌耐药细胞的体外侵袭和转移，这可能与Triptorelin 抑制EGF 诱发的EGFR信号通路的激活，改变MMP-2，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2蛋白的表达有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一部分人卵巢癌顺铂耐药细胞亚系的诱导及其裸鼠皮下荷瘤模型的建立

第二部分促性腺激素释放激素激动剂通过EGFR-MAPK-ERK1/2信号通路对人耐药卵巢癌细胞化疗敏感性的影响

第三部分GnRH激动剂通过下调EGF诱发的MMP-2和MMP-9的表达而抑制耐药卵巢癌细胞的侵袭和转移

课题小结

综述：促性腺激素释放激素类似物治疗卵巢癌的研究进展

参考文献

致谢

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