膳食铁补充对心理应激大鼠血糖水平的影响及其机制研究

摘要

近年来，铁过负荷问题备受关注，由于各种原因造成的机体铁过量，导致的氧化应激损伤，在神经退行性疾病、冠心病等常见疾病的发生发展中起到重要作用。国内外研究还发现，体内铁过负荷与胰岛素抵抗及糖尿病的发生发展之间也存在某些联系。
　　 人群调查发现血清铁蛋白（SF）升高与胰岛素含量及血糖水平呈正相关，提示铁负荷增加可能与糖尿病风险升高有联系；动物实验也证实给小鼠腹腔注射三乙酸铁可导致其胰岛β细胞和肝细胞的铁沉积：胰腺铁沉积可造成胰岛β细胞凋亡、胰岛素分泌水平下降；肝铁沉积可导致肝细胞胰岛素抵抗。上述影响的结果均会使得血糖水平明显升高。
　　 然而，近年来有研究者认为，机体铁营养状况与糖尿病的发生发展之间无必然联系。还有学者提出，只有血红素铁的过度摄入会增加患糖尿病的风险。关于这方面的研究尚无定论。
　　 随着现代社会科技的进步以及生活节奏的加快，人们经常处于应激状态，像军人由于保家卫国的需要，经常要面对突发性事件，如战争爆发，执行特种任务等，这些特殊情况和特种作业条件都容易诱发军人应激反应。众所周知，机体应激时激素的分泌，例如糖皮质激素、儿茶酚胺类激素、胰高血糖素水平大幅度的升高和胰岛素分泌的减少，均会导致血糖水平升高。应激所诱发的应激性高血糖是糖尿病的诱因之一。因此，预防应激时血糖水平的过度升高对保障应激人群的健康具有重要意义。
　　 现实生活中，铁的补充常常作为预防缺铁性贫血、低出生体重等营养缺乏病的有效策略而存在。而且我们的预实验发现，膳食铁的补充会引起应激大鼠血糖水平显著且持续的升高。所以了解膳食铁的补充对血糖尤其是应激血糖的影响，对保障应激人群的健康均具有积极意义。本文为阐明这些问题进行了系统研究。
　　 研究目的：
　　 了解膳食铁补充与血糖的关系，初步探讨血糖水平变化的原因，为经常处于应激状态的人群（如军人、运动员等）膳食铁供给量的制定提供实验依据。
　　 方法：
　　 一、心理应激模型的制作
　　 利用Communication box system，制作大鼠心理应激模型。Communication boxsystem是由透明丙烯酸板构成，由A、B小室间隔组成。A 室铺绝缘胶管，B 室通电。在B 室的大鼠接受30min/d的足底电击（电压80V），跳跃尖叫；A 室的大鼠通过视觉和听觉等产生恐惧的心理应激。通过ELISA和RIA的方法检测大鼠血清CORT、ACTH、NE和EPI的水平来判定心理应激模型的建立成功与否。
　　 二、膳食铁的补充对心理应激大鼠血糖水平的影响
　　 （一）膳食铁含量的设定
　　 膳食铁含量为80mg/kg的饲料作为正常铁饲料（参考文献）；膳食铁含量加倍作为膳食中铁组（160mg/kg）；在此基础上， 铁含量再次翻倍作为膳食高铁组（320mg/kg）。
　　 （二）实验动物及分组：
　　 大鼠接受心理应激暴露一周，膳食铁的补充对应激大鼠血糖水平的影响：60只雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司)，体重（120±5）g。适应性喂养7天，期间喂饲铁含量为80mg/kg的饲料。随后将各组大鼠按体重随机分为6组，分别为正常铁对照组（NC），正常铁+心理应激组（NP），中铁对照组（MC），中铁+心理应激组（MP），高铁对照组（HC），高铁+心理应激组（HP），每组8只。其余作为电击组。动物饲养在清洁级动物房，环境温度为24℃±1℃，相对湿度为40％～60％。全部单笼饲养，自由饮食及去离子水。12h/12h 自然昼夜节律变化光照。
　　 大鼠接受心理应激暴露两周，同时补充膳食高铁，两周内应激大鼠血糖水平的改变：32只雄性SD大鼠，体重（120±5）g，用80mg/kg的含铁饲料适应性喂养7天后，随机分为四组，分别为正常铁对照组（NC），正常铁应激组（NP），高铁对照组（HC）和高铁应激组（HP）。实验时间为两周。
　　 （三）实验大鼠的处理
　　 一周组：正常铁对照、中铁对照、高铁对照三组分别喂饲膳食铁含量为80、160、320mg/kg的饲料；正常铁应激，中铁应激，高铁应激三组在喂饲相应膳食铁饲料的基础上，接受心理应激暴露。连续实验处理7天。
　　 两周组：正常铁对照组喂饲铁含量为80mg/kg的饲料，高铁组喂饲320mg/kg的饲料，心理应激模型的制作方法同上。连续实验处理14天。
　　 （四）大鼠体重以及饲料消耗量的测定
　　 电子天平称量大鼠体重；每天更换大鼠鼠粮，用电子天平准确称量每天饲料量，计算大鼠饲料日消耗量和大鼠的平均体增重。
　　 （五）大鼠血糖水平的检测
　　 在实验处理前一天，对各组大鼠禁食6小时后，测定各组大鼠的空腹血糖值；在心理应激暴露的第偶数天，对各组大鼠禁食6小时，应激暴露后1小时内，取大鼠尾静脉血，利用Accu-Chek Active (罗康全活力型) 血糖仪，测定各组大鼠的空腹血糖水平。
　　 三、膳食铁的补充对应激大鼠血清、肝脏、胰腺铁水平及肝脏氧化应激损伤的影响
　　 （一）实验动物分组及处理
　　 与上面的一周组为同一批实验动物。实验动物的分组、处理及饲养条件同前。（心理应激模型制作方法同前。）
　　 （二）膳食铁的补充对心理应激大鼠糖化血清蛋白以及血清、肝脏、胰腺铁含量的
　　 影响
　　 实验处理结束后，立即麻醉各组大鼠，腹主动脉取血，心脏灌流后取肝脏、胰腺等组织。血液离心后，取血清。利用GSP 试剂盒检测大鼠糖化血清蛋白水平。血清和组织经过相应的消化处理后，利用原子吸收分光光度计法测定各组大鼠血清、肝脏及胰腺铁含量。
　　 （三）膳食铁的补充对心理应激大鼠肝脏氧化应激损伤的影响
　　 利用过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成的红色产物在532nm 处有最大吸收峰的原理，检测各组大鼠肝脏MDA 含量。利用相应的试剂盒检测肝脏组织内抗氧化酶SOD、GSH、GPx的活性，结合肝脏内MDA 含量，评价肝脏组织的氧化应激损伤程度。
　　 四、膳食铁补充对心理应激大鼠应激激素及胰岛素信号通路中蛋白磷酸化水平的影响
　　 （一）实验动物及分组：
　　 购买上海西普尔-必凯公司的雄性SD大鼠108只，体重（120±5）g。用膳食铁含量为80mg/kg的饲料适应性喂养7天后，按体重随机分为3组，分别为两天组，七天组，两周组。每个组分为四个亚组，分别为正常铁对照组（NC），正常铁应激组（NP），高铁对照组（HC），高铁应激组（HP）。每个亚组8只SD大鼠，其余12只作为电击组，接受足底电击。动物饲养条件同上。自然昼夜节律变化光照。
　　 （二）实验大鼠的处理
　　 正常铁对照、高铁对照组分别喂饲膳食铁含量为80、320mg/kg的饲料；正常铁应激，高铁应激组在喂饲相应饲料的基础上，加心理应激暴露。两天组，七天组，两周组分别给予心理应激暴露两天，七天，两周的时间。（心理应激模型的具体制作方法同前）
　　 （三）两周内，膳食铁补充对应激大鼠血糖水平的影响
　　 测定的具体方法及条件同第一部分。
　　 （四）膳食铁的补充对心理应激大鼠血糖相关应激激素（如皮质酮，肾上腺素，胰高血糖素、胰岛素）的影响
　　 利用RIA 试剂盒检测各组大鼠血清皮质酮和肾上腺素水平；利用R&D 公司的ELISA 试剂盒检测大鼠血清肾上腺素、胰岛素的浓度，了解膳食铁的补充对心理应激大鼠血糖相关应激激素的影响。
　　 （五） 膳食铁的补充对心理应激大鼠肝细胞胰岛素信号通路中IRS 以及Akt 磷酸化
　　 利用Western-bloting的方法，检测胰岛素受体信号通路中pIRS-1、IRS-1、pAkt、
　　 Akt的蛋白水平，通过pIRS-1/IRS-1与pAkt/Akt的变化，了解膳食铁的补充对心理的影响
　　 （六）膳食铁的补充对心理应激大鼠肝糖原含量的影响
　　 采用相应的试剂盒，采用蒽酮法测定各组大鼠肝糖原含量，了解膳食铁的补充对应激大鼠肝糖原含量的影响。
　　 五、统计方法
　　 利用SPSS16.0对数据进行统计描述后，利用单因素方差分析（包括利用LSD,SNK进行两两比较），重复测量设计资料的方差分析等方法对数据进行统计处理。实验数据以平均数±标准差(`X±S)表示，以P<0.05作为有统计学意义的阈值。
　　 结果：
　　 一、膳食铁的补充对心理应激大鼠血糖水平的影响
　　 （一）膳食铁的补充对心理应激大鼠饲料消耗量的影响
　　 实验期间，应激暴露后，大鼠饲料消耗量与相应对照组相比，无统计学意义（P>0.05）；正常、中、高铁对照组三组相比，其饲料消耗量均无统计学意义（P>0.05）；正常、中、高铁应激组相比，大鼠饲料消耗量也无统计学意义（P>0.05）。
　　 （二）膳食铁的补充对心理应激大鼠平均体增重的影响
　　 实验期间，正常、中、高铁应激组的平均体增重显著下降，且与相应的对照组相比存在统计学意义（P<0.05），下降幅度分别为13.51％，13.55％，16.79％。
　　 （三）膳食铁的补充对心理应激大鼠血糖水平的影响
　　 应激暴露后，应激组大鼠在实验的第二天、第四天血糖水平均显著升高，且与相应的对照组相比存在统计学意义（P<0.05），随着应激暴露时间的延长，到第六天时，仅高铁应激组与高铁对照组相比，血糖水平升高，且存在统计学差异（P<0.05），正常铁应激组血糖水平降低，与正常铁对照组无显著差异（P>0.05）。单纯膳食高铁的补充仅在实验的第二天引起血糖水平的一过性升高，而继续高铁饲料的摄入，血糖水平逐渐下降，到第六天时，其血糖水平与正常铁对照组相比，已无统计学意义（P>0.05）。
　　 膳食高铁的补充会引起应激大鼠血糖水平显著且持续的升高，延长应激大鼠膳食铁补充的时间至两周，发现趋势相同。在整个实验期间，高铁应激组的血糖水平一直处于较高水平，与正常铁对照组及正常铁应激组相比，均存在统计学意义（P<0.01）。
　　 二、膳食铁的补充对应激大鼠血清、肝脏、胰腺铁水平及肝脏氧化应激损伤的影响
　　 1.膳食铁补充对应激大鼠糖化血清蛋白的影响
　　 正常铁应激组大鼠其GSP水平与正常铁对照组相比，无统计学意义（P>0.05）；膳食高铁的补充会引起应激大鼠GSP水平升高（p<0.05）；延长膳食铁的补充时间至两周，高铁应激组大鼠的GSP水平显著升高，且与正常铁对照组相比存在统计学意义（p<0.01），且与一周高铁应激组相比，同样存在统计学意义（p<0.05）。
　　 2.膳食铁的补充对心理应激大鼠血清、肝脏以及胰腺铁含量的影响
　　 利用原子吸收分光光度法测定各组大鼠血清、肝脏以及胰腺的铁含量。应激后，大鼠肝脏铁及胰腺铁含量升高（P<0.01），血清铁含量下降（P<0.05）；与正常铁对照组相比，随着膳食饲料中铁含量的上升，血清铁、肝铁以及胰腺铁水平也随之增加（P<0.05）；而对于应激组大鼠，膳食铁的补充会进一步显著增加肝脏内的铁含量，且与正常铁应激组相比，存在统计学意义（P<0.01），另一方面，膳食铁的补充对应激暴露引起血清铁水平下降的状况有所改善。
　　 3．膳食铁的补充对心理应激大鼠肝脏氧化应激损伤的影响
　　 心理应激暴露会引起大鼠肝脏组织氧化应激损伤指标的改变：MDA 含量升高，而其他的抗氧化酶（如SOD、GSH、GPx）的活性下降，且与相应的对照组相比均存在统计学差异（P<0.05）。提示应激后肝脏氧化应激损伤增强；而高铁膳食的补充，会进一步加重应激大鼠肝脏组织的氧化应激损伤程度（P<0.01）。
　　 三、膳食铁补充对心理应激大鼠应激激素及胰岛素信号通路中蛋白磷酸化水平的影响
　　 1．两周内，膳食铁补充对应激大鼠血糖水平的影响
　　 膳食铁的补充同样仅在实验的第二天引起大鼠血糖水平的一过性升高，而对于应激大鼠来讲，膳食高铁的补充也引起其血糖水平显著且持续的升高，且在整个实验期间内，与正常铁对照组相比，均有显著性差异。血糖水平变化趋势在一周组和两周组，变化趋势相同。
　　 2.膳食铁的补充对两天组、七天组以及两周组心理应激大鼠皮质酮、肾上腺素、胰高血糖素、胰岛素等血糖相关应激激素的影响
　　 两天组：心理应激大鼠应激相关激素（如皮质酮，肾上腺素，胰高血糖素）水平升高，胰岛素水平下降，且与正常铁对照组相比存在统计学差异（P<0.05）；单纯膳食高铁的补充会使得大鼠血清皮质酮，肾上腺素，胰岛素水平显著升高，且与正常铁对照组相比，有统计学差异（P<0.05）；而对于应激组大鼠，高铁膳食的补充仅会升高应激大鼠血清胰岛素的水平，且与正常铁应激组相比，存在统计学意义（P<0.05）。七天组：心理应激暴露后，皮质酮、肾上腺素的水平显著升高，胰岛素水平显著下降，且与正常铁对照组相比，存在统计学差异（P<0.05），而胰高血糖素含量没有明显改变；高铁膳食的补充会引起SD大鼠血清胰岛素水平的升高（P<0.01），其他的应激激素水平无明显改变（P>0.05）；对于应激组大鼠，高铁膳食的补充会进一步显著升高其血清皮质酮，肾上腺素以及胰岛素的水平，且与正常铁应激组相比，有统计学意义（P<0.05）。
　　 两周组：正常铁应激组大鼠的血清肾上腺素水平显著升高，且与正常铁对照组相比，有统计学意义（P<0.05），皮质酮水平下降到与正常铁组无统计学差异（P>0.05），血清胰岛素水平下降（P<0.05），胰高血糖素水平无显著改变（P>0.05）；单纯膳食高铁的补充，均未引起血糖相关应激激素（如皮质酮，肾上腺素，胰高血糖素，胰岛素）水平的改变（P>0.05）；高铁应激组大鼠的血清皮质酮水平显著升高，且与相应的对照组以及正常铁应激组相比，有统计学意义（P<0.05）。
　　 3.膳食铁的补充对心理应激大鼠肝细胞胰岛素信号通路中IRS-1以及Akt 磷酸化水平的影响
　　 心理应激暴露后，正常铁应激组组IRS-1以及PKB/Akt 磷酸化水平未有显著改变（P>0.05），高铁应激组与高铁对照组相比，IRS-1和Akt 磷酸化水平下降（P<0.05）；单纯膳食高铁的补充仅会引起Akt 磷酸化水平的下降（P<0.05）；与正常铁对照组及正常铁应激组相比，高铁应激组的IRS-1以及Akt的磷酸化水平均显著下降（P<0.05）。
　　 4.膳食铁的补充对心理应激大鼠肝糖原含量的影响
　　 实验结果发现，单纯膳食高铁的补充会引起肝糖原含量的显著降低，且与正常铁对照组相比，存在统计学差异（P<0.05）；心理应激暴露后，仅高铁应激组与其相应的对照组相比，肝糖原含量降低（P<0.01）。
　　 结论：
　　 通过Communication box system 成功制作大鼠心理应激模型。通过观察膳食铁的补充对心理应激大鼠血糖水平的影响，了解其组织铁含量以及氧化应激损伤的变化，并初步探讨膳食高铁能够引起心理应激大鼠血糖水平显著且持续升高的机制。主要结论如下：
　　 1.单纯膳食铁的补充仅在实验的第二天引起SD大鼠血糖水平一过性的升高，而对于应激暴露大鼠，高铁膳食的补充会引起血糖水平显著且持续的升高。延长应激大鼠膳食铁补充的时间至两周，血糖水平变化趋势相同。高铁应激组的糖化血清蛋白水平显著高于正常铁对照组，且两周高铁应激组的GSP水平显著高于一周组。
　　 2.心理应激暴露后，大鼠的肝脏以及胰腺组织内的铁含量显著升高，血清铁水平显著下降；膳食铁的补充会加重肝铁、胰腺内的铁蓄积状况，但是其补充会显著改善应激造成的血清铁下降。对于肝脏来讲，应激暴露后，肝脏MDA 含量上升，抗氧化酶活性下降；而膳食高铁的补充会进一步显著加重应激大鼠肝脏的氧化应激损伤程度。
　　 3.高铁膳食的补充可能会影响应激大鼠激素的水平，延缓大鼠应激适应，从而使得血糖水平显著升高；另一方面，膳食高铁的补充加重了应激大鼠肝脏的氧化应激损伤，可能会通过影响胰岛素信号通路中IRS-1和Akt的磷酸化水平，导致血糖水平的改变。
　　 综上所述，膳食铁补充可以引起应激大鼠血糖水平显著且持续的升高，一方面可能是由于铁的补充影响了机体应激激素的水平，延缓了大鼠应激适应而导致的；另一方面，膳食铁的补充进一步增加了应激大鼠的肝脏铁含量，进而加重了应激大鼠肝脏氧化应激损伤水平，通过影响胰岛素信号通路中IRS-1和PKB/Akt的磷酸化水平，导致血糖摄取利用降低，血糖水平升高。
　　 另外研究中发现，膳食铁补充一方面可改善应激导致的血清铁下降，另一方面其补充可加重应激造成的肝脏氧化应激损伤，与前期研究结果相同。这些均提示，为了促进应激人群的健康，对有关该人群的适宜铁摄入量应进行进一步的研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

前言

第一部分膳食铁补充对心理应激大鼠血糖水平的影响

第二部分膳食铁补充对心理应激大鼠血清、肝脏、胰腺铁含量及肝脏氧化应激损伤的影响

第三部分膳食铁补充影响心理应激大鼠血糖水平机制的初步探讨

全文总结

综述 铁负荷与糖代谢异常

在读期间已投稿论文

致谢