大电导钙依赖的钾离子通道(MaxiK/Bkca)在三叉神经病理性痛中的作用研究

摘要

[目的]
　　 本实验经颧骨下缘入路的新方法建立大鼠三叉神经病理性痛模型—眶下神经慢性缩窄环术(ION—CCI)，经眶下孔注射高渗盐水阿霉素混合溶液在结构上确立了达三叉神经节目标注射给药法。同时运用该注射方法，在正常大鼠上分别比较了注射ATP和生理盐水，以及经眶下孔达三叉神经节目标注射给药和一般注射给药的差异。在假手术和ION—CCI模型组大鼠上分别注射不同浓度的BKca通道激动剂NS1619以及BKca通道特异性拮抗剂IbTX，观察给药后大鼠的面部机械刺激行为学变化。运用QT—RT—PCR，western blotting，免疫荧光组织化学以及全细胞膜片钳记录的方法分别研究假手术组和ION—CCI组大鼠术侧三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)BKca，通道在mRNA和蛋白水平表达的变化，以及其在神经元兴奋性中的作用，初步探讨大电导钙依赖的钾通道(MaxiK/BKca)在三叉神经痛中的作用及外周机制。
　　 [方法]
　　 1．动物分组
　　 SD雄性大鼠(200—250g)，随机分成两组，一组行ION—CCI手术构建三叉神经病理性痛模型，一组行假手术，神经不结扎。
　　 2．ION—CCI手术
　　 2％戊巴比妥钠行腹腔注射(50 mg/kg体重)麻醉。沿大鼠右颊部颧骨下缘前1/3段(靠近鼻背部)做长约1 cm切口，钝性分离，暴露眶下孔，显露眶下神经。从近端向远端分离约4～5 mm的长度。显微镜下两根铬肠线(4—0)间距约2 mm结扎眶下神经，力度适中。压迫标准：镜下可见结扎线使神经的直径略微变细，但不能完全阻断其传导且神经外膜的血液循环必须通畅。假手术组以同样方法暴露眶下神经，但不结扎。
　　 3．痛阈测定
　　 使用弗莱毛测量大鼠面部机械痛阈。弗莱毛的力量分别为：1(0．0115g)、2(0．0229g)、3(0．0358g)、4(0．052g)、5(0．1g)、6(0．494 g)、7(0．634g)、8(1．19g)、9(2．05g)、10(4．01 g)、11(6 g)、12(8．08g)、13(10．8 g)、14(12．2 g)、15(14．9 g)。从细到粗，每个力度的弗莱毛刺激右侧面部触须垫部位10次，以大鼠有躲闪、逃避、攻击等相关疼痛反应行为记为阳性，10次中有6次或者6次以上记录为阳性时，认为此时弗莱毛相对应的克数即为大鼠面部机械痛阈值。
　　 4．RT—PCR测定
　　 (1)RNA分离和cDNA合成
　　 大鼠断头致死后，迅速取出TG，用Trizol提取液提取总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度(A260/280)，同时行RNA定量。提取的RNA中，每样本取2μg在20μl体系中反转录成cDNA，—20℃保存，用于实时定量聚合酶联反应扩增BKca通道基因。
　　 (2)RT—PCR
　　 用于扩增BKca通道α基因的引物对为：AGGAATGCATCTTGGCGTCACTC(正义)，CCTCGAAGTGCATTCTCCTCAGC(反义)；反应条件为：94℃，5min，94℃，35s；58℃，90s；72℃，90s。用于扩增BKca通道β1基因的引物对为：ATGGAGGCTCAACCCAGATGG(正义)，CCCATCTGCCCACAGCTGATA(反义)，β2基因的引物对为：ACTGCTGCGCTCGTACATGCA(正义)，CGTTGGCCAGAAGAGAGAATGGA(反义)；β3基因的引物对为GGCTGTAGAACCACCCAAGTC(正义)，TCTTCTCTGGGAGAGCTGAC(反义)：β4基因的引物对为CGAAGCTCAGGGTGTCTTACG(正义)，CAGTGCAGGAGGACAATCTCG(反义)，β1、2、3、4基因反应条件均同α基因；β—actin基因的引物对为ATGGTGGGTATGGGTCAGAAG(正义)，TGGCTGGGGTGTTGAAGGTC(反义)，反应条件为：95℃，2min，95℃，20s；58℃，25s；72℃，25s。
　　 5．Western blotting
　　 大鼠断头致死后，迅速取出TG，用RIPA蛋白裂解液迅速裂解蛋白匀浆，BSA法紫外分光光度计(wave595)测蛋白浓度，同时行蛋白定量。提取的样本中，每次取60μg蛋白上样电泳，恒压120V电泳90min，随后恒流300mA转膜120min，脱脂牛奶封闭，洗膜，BKca通道一抗孵育4℃过夜，隔天洗膜，常温孵育BKca通道二抗60min，显影拍照测量灰度并统计分析。
　　 6．免疫荧光组织化学
　　 大鼠轻度麻醉后用4％多聚甲醛灌流，迅速取出TG，PBS缓冲液漂洗，4％多聚甲醛固定约4h，再用20％蔗糖溶液浸泡48h后制做冰冻包埋切片，滴加BKca通道，NeuN一抗孵育过夜，隔日常温孵育BKca通道、NeuN二抗，荧光显微镜下观察。
　　 7．全细胞膜片钳
　　 大鼠断头处死，急性分离培养大鼠三叉神经节(trigeminal ganglion，TG)神经元上，通过全细胞膜片钳方法分别记录BKca激活电流，比较对照组和手术组间BKca激活电流的差异。
　　 [结果]
　　 1．大鼠行ION—CCI术后，术侧面部机械痛阈逐渐降低，术后第6天，大鼠右侧面部机械痛阈显著下降，术后第15天(P<0．001 vs sham group)面部机械痛阈值降到最低，可以引起三叉神经病理性痛样反应。
　　 2．运用经眶下孔与正中线成5度角向前向上进针深度约20mm的方法，注射高渗盐水阿霉素混合溶液，取三叉神经节切片绿色荧光显微镜下观察，阿霉素布满神经元细胞。新注射方法可以直接到达三叉神经节——初级感觉传入神经元，从结构上证明了该注射方法的有效性。
　　 3．在正常大鼠上运用经眶下孔达三叉神经节注射方法，分别注射100μM ATP和生理盐水，结果在给予ATP10min后，大鼠面部机械痛阈显著降低，并可以维持60min左右，随后逐渐恢复，150 min后恢复至给药前状态；而在注射生理盐水后大鼠面部机械痛阈无显著变化，仅在给药10 min时出现暂时性降低，之后痛阈很快恢复到正常水平。分别运用经眶下孔达三叉神经节目标注射给药法和经眶下孔下一般注射给药法注射100μM ATP结果显示用两种注射方法注射ATP后均能诱导痛觉增敏，一般眶下孔注射法给药后10 min之内大鼠面部机械痛阈迅速降低，随后逐渐恢复，80min后恢复正常；而经眶下孔达三叉神经节目标注射后，在60min内，大鼠面部的机械痛阈持续维持于较低的水平，60 min后逐渐恢复，150 min恢复到正常水平。以上研究结果提示，和一般眶下孔注射给药相比，经眶下孔达三叉神经节目标注射法给药，其作用时间更持久，注射效率更高，进一步在功能上证明了该注射方法的可靠性和有效性。
　　 4．在ION—CCI术后15天大鼠上，运用经眶下孔达三叉神经节目标注射给药法分别注射20，50，100μgNS1619，可以剂量依赖性地增加大鼠面部痛阈，起到抗痛效应，同时注射20ng BKca通道特异性拮抗剂IbTX可以明显地抑制该抗痛效应，而注射生理盐水对痛阈无明显影响。同样在假手术组大鼠上也进行了类似的给药注射，各给药组间无明显差异。在ION—CCI术后64天痛阈恢复中的大鼠上目标注射20ng IbTX可以明显引起大鼠面部机械痛觉异常。
　　 5．分别取术后第15天ION—CCI和Sham组大鼠TG，RT—PCR结果显示，BKca通道的组成性α亚基以及调节性的p2、β4亚基大量表达，而调节性的β1、β3亚基不表达．α、β2、β4亚基片段长度分别为511bp，409bp和514 bp。QT—RT—PCR结果显示，ION—CCI术后大鼠BKca通道的α、β2、β4亚基在mRNA水平表达较Sham组均显著下降，westernblottig结果提示，ION—CCI术后大鼠TG上的BKca通道蛋白表达含量较Sham组显著下降。
　　 6．在正常大鼠TG分离培养的神经元，全细胞膜片钳记录BKca通道电流，用BKca激动剂可以显著抑制TG神经元的兴奋性。分别取术后第15天ION—CCI和Sham组大鼠TG，全细胞膜片钳记录BKca通道电流，结果显示ION—CCI术后手术组BKca通道的激活电流相对于假手术组显著降低，且该电流可以被BKca通道拮抗剂IbTX所阻断。
　　 [结论]
　　 1．三叉神经病理性痛中BKca通道激动剂NS1619具有抗痛效应，提示BKca通道激动剂可以成为临床上治疗三叉神经痛新药开发的重要靶点。
　　 2．ION—CCI术后引起的三叉神经病理性痛，与TG中组成性α亚基以及调节性β2、β4亚基的表达降低有关，提示这三种亚基参与了三叉神经病理性痛的形成。

目录

文摘

英文文摘

缩写词表

前言

材料与方法

一、主要仪器与试剂

二、实验方法

结果

一、ION-CCI术后大鼠面部机械痛阈的变化

二、经眶下孔达三叉神经节目标注射给药法的注射部位确定

三、经眶下孔达三叉神经节目标注射法与一般眶下孔注射法药效差异

四、经眶下孔目标注射BKca通道激动剂NS1619和特异性拮抗剂IbTX对假手术和模型组大鼠面部机械痛阈的影响

五、BKca通道各亚基mRNA在TG的表达

六、ION-CCI组和假手术组术侧TG中BKca通道各亚基mRNA和蛋白表达差异

七、ION-CCI与假手术大鼠TG神经元兴奋性的差异

八、TG神经元BKca通道功能及其在神经元兴奋性中的作用

九、ION-CCI组和假手术组TG神经元BKca通道功能差异

讨论

结论

参考文献

文献综述

参考文献

在读期间发表论文和参加科研工作情况说明

致谢