高压氧后处理对SNI小鼠疼痛行为学和LTBP-1的影响

摘要

神经病理性疼痛是原发于神经系统的损伤或功能障碍引起的疼痛，关于神经元和胶质细胞的研究部分揭示了伤害感受性信号传导和疼痛的病理机制，而这些细胞所处的环境在疼痛的机制中也扮演着重要的角色，细胞外基质蛋白不仅对细胞起支持作用，还可能是神经病理性疼痛的生物标记与治疗靶点。 外周神经纤维的损伤，导致从感觉神经纤维末梢到大脑皮质高级感觉中枢的疼痛传导通路，发生异位放电，传导或神经递质改变，结构重塑，中枢敏化，促使伤害感受信号持续作用，形成慢性疼痛，主要表现为针刺、电灼、撕裂、刀割样疼痛，以自发性疼痛，触诱发痛或称异常性疼痛（allodynia）和痛觉过敏（hyperalgesia）为特征。 临床常见的神经病理性疼痛包括痛性糖尿病性神经病变、带状疱疹后遗神经痛、三叉神经痛、卒中后疼痛、脊髓损伤性疼痛，以及创伤或手术相关神经损伤导致的慢性疼痛。物理治疗如经皮神经电刺激，药物治疗如抗抑郁药、抗惊厥药、阿片类药、局部外用利多卡因或辣椒碱贴剂，微创治疗如A型肉毒素注射、神经射频、脊髓电刺激植入、鞘内巴氯酚持续输注等，有减轻疼痛的作用，但疗效尚不能达到临床满意。 近年来有研究发现高压氧治疗在动物模型或人类都能减轻疼痛，可能的机制是通过减轻组织水肿和缺氧，改善微环境，促进毛细血管和神经组织再生，抑制炎症反应和炎性因子，促发对氧化应激的适应，抑制c-Fos表达，激活胶质细胞，提高脊髓背角疼痛信号通路递质的磷酸化水平，影响脊髓背角阿片受体，但其对神经病理性疼痛的作用及机制尚不明确。 转化生长因子-β（transforming growth factor-beta,TGF-β）家族以无活性的复合物形式存在，活化后能够调节神经元兴奋性和抑制性传递，影响认知、情感行为的变化，抑制神经免疫反应。LTBP-1(latent TGF-βbinding protein)是TGF-βs靶向与激活的重要调控物质，已发现主要表达在心脏、胎盘、肾脏，在肺、肝、骨骼肌、胰腺也有表达，而LTBP-1在神经系统的表达分布及其作用尚不明确。 研究神经病理性疼痛比较常用的动物模型有坐骨神经部分或完全离断的模型，脊神经根结扎损伤，背根神经节损伤模型，此外还有脊髓或脑损伤模型。其中神经部分损伤模型作为神经病理性疼痛机制研究和药物筛选的工具，会24小时内就出现疼痛，且行为学改变能维持6个月以上。 为研究高压氧处理对神经病理性疼痛的作用，探索LTBP-1在神经病理性疼痛发生发展中的作用，开展了进一步的研究。研究方法：首先制备了小鼠坐骨神经部分损伤模型,给予高压氧、常氧高压或空气干预，测定高压氧处理对小鼠行为学缩爪机械痛阈的影响。通过Western Blot的方法分别测定LTBP-1在各组小鼠背根神经节与脊髓蛋白水平的表达变化情况。用免疫组织化学荧光染色方法观察LTBP-1在各组小鼠脊髓和背根神经节的表达分布。此后，在正常C57小鼠腰4-5节段脊髓与双侧背根神经节取材，分别使用Neu-N抗体、NF-200抗体、CGRP抗体与LTBP-1进行共同染色，进一步明确LTBP-1在脊髓与背根神经节表达的细胞类型。用SPSS软件包分析计量资料，结果用（均数±标准差）来表示,用单因素方差分析比较多个样本均数间的差异；半定量资料以R语言软件进行数据分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。模型制备成功后,测定缩爪机械痛阈发现：与正常对照组、假手术组比较，模型组的机械痛阈降低,p＜0.05。与SNI-HB或SNI-NA组比较，SNI-HBO组的机械痛阈升高,p＜0.05。Western-blot法检测L4-5脊髓组织发现：LTBP-1在高压氧处理组脊髓组织中的表达增加，与常氧高压组或空气组比较有统计学意义（p＜0.05）；而后两组之间无统计学差异（p＞0.05），这提示高浓度氧气是影响LTBP-1水平的重要因素，当空气压力增加到0.2MPA，而氧浓度近似于空气时，LTBP-1表达水平的变化无统计学意义。在背根神经节组织中，高压氧组LTBP-1的表达与常氧高压组比较有统计学意义（p＜0.05），这提示高浓度氧气可能影响了背根神经节上LTBP-1的表达水平。免疫荧光组织化学染色检测LTBP-1在各组小鼠背根神经节的表达结果：阳性反应主要在背根神经节神经元的胞浆内和细胞外基质表达，在神经纤维上也有阳性表达，高压氧处理组背根神经节的LTBP-1阳性表达较多。免疫荧光双重染色观察：LTBP-1与DAPI共同染色，可见LTBP-1在脊髓背角有阳性表达；与NEU-N在脊髓神经元的神经细胞的胞浆内有共同表达；在NF-200抗体呈阳性的细胞也有表达；与CGRP共同染色呈阳性反应。 本研究首次证实，高压氧对坐骨神经部分损伤引起的神经病理性疼痛有治疗作用，LTBP-1在脊髓和背根神经节的神经元胞浆内和细胞外基质中、以及在神经纤维有阳性表达。高压氧处理能使LTBP-1的表达水平升高。高压氧可能通过增加LTBP-1，激活TGF-β复合物，活化TGF-β，发挥免疫抑制等作用，减少炎性物质的释放，抑制胶质细胞与神经元的相互作用，从而减轻神经系统损伤；还可能作用于降钙素基因相关肽（calcitonin-gene related peptide，CGRP）能神经元，影响疼痛信号传导通路，减轻神经病理性疼痛，这需要未来进一步的电生理研究来证实。

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