NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究

摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 热应激损伤作用研究
　　目的:通过体外、体内实验研究初步探讨热应激对细胞及组织的损伤作用。
　　方法:1.体外研究。(1)热应激对细胞的损伤作用:分离C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞，接种于六孔板中培养。实验分为4个大组:37℃空白对照组、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)复合38℃热应激组、LPS复合40℃热处理组和LPS复合42℃热应激组。每大组内设置三个热应激时间点(1 h、2h、4h)。空白对照组细胞置于37℃细胞培养箱中正常培养1h、2h、4h; LPS复合热应激组细胞在加入LPS（100 ng/ml）预处理6h后，分别置于38℃、40℃、42℃培养箱中培养1h、2h、4h。处理结束后，显微镜下观察细胞形态，MTT法检测细胞的存活率，试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)的释放水平。(2)热应激后炎症细胞因子的释放:分离、培养C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞。实验分为空白对照组、LPS组、热应激组、LPS复合热应激组。其中，LPS复合热应激组细胞经LPS预处理6h后，在38℃、40℃、42℃条件下分别孵育1h、2h、4h。ELISA法检测细胞上清白细胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。2.体内研究。(1)C57BL/6小鼠分为正常对照组和LPS复合38℃、40℃和42℃热应激组，每组5只小鼠。LPS复合热应激组小鼠腹腔注射LPS（1 mg/kg），4h后给予不同温度的热刺激。测定各组小鼠初始及热应激2h后（或濒死时）的肛温，存活小鼠在热应激2h后处死，取血测定血清IL-1β。(2)C57BL/6小鼠分为正常对照组和LPS组，检测LPS处理4h后小鼠血象变化。(3)C57BL/6小鼠分为正常对照组、LPS组、热应激组和LPS复合40℃热应激组，每组10只小鼠。受热后每隔15 min监测四组小鼠肛温变化直至达到热射病标准42.7℃，记录生存时间绘制生存曲线。
　　结果:1.体外研究。(1)热应激对细胞的损伤作用:LPS复合42℃，4h热应激处理后，细胞形态发生明显变化，细胞萎缩，体积变小，细胞间隙变大，细胞膜轮廓模糊，细胞死亡过半。LPS复合40℃，4h与LPS复合42℃，2h热应激处理后细胞少量死亡。其他处理组细胞形态无明显变化。MTT测定结果显示，腹腔巨噬细胞经不同温度不同时间热应激后，LPS复合42℃，4h热应激组细胞的存活率较其他组明显降低，其余各组之间细胞存活率没有明显差异。LDH测定结果显示，37℃正常孵育1h、2h、4h，细胞上清中LDH含量均较低，细胞经LPS预处理后在38℃、40℃、42℃条件下孵育1h、2h和4h，LDH释放量随着热应激温度与时间的增加有依赖性的升高，其中，LPS复合42℃，2h热应激组和LPS复合42℃，4h热应激组细胞LDH的释放量与空白对照组相比有显著差异。(2)热应激后炎症细胞因子的释放:与空白对照组相比，LPS组、LPS复合热应激各组细胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均显著升高。但与LPS组相比，LPS复合热应激组细胞上清中仅IL-1β的含量明显升高，提示LPS复合热应激仅进一步促进IL-1β的分泌。2.体内研究。(1)LPS复合热应激2h（不足2h的濒死即刻测量）后，40℃热应激组小鼠和42℃热应激组小鼠肛温均高于38℃组。血清ELISA结果显示LPS复合40℃热应激小鼠的血清IL-1β水平高于38℃和42℃热应激组小鼠。(2)LPS(1 mg/kg)处理4h后，小鼠血液中白细胞量(White blood cell，WBC)和淋巴细胞比例（％LYMPH）较空白对照组相比显著降低，中性粒细胞比例(％NEUT)相比于空白对照组显著升高。(3)监测正常对照组、LPS组、热应激组和LPS复合40℃热应激组小鼠体温发现，空白对照组和LPS组小鼠实验期间前后肛温无明显变化，单纯热应激组小鼠肛温平缓升高。LPS复合热应激组小鼠受热15 min后肛温较单独热应激组迅速升高，且率先达到热射病标准温度42.7℃。生存分析结果显示，LPS组野生型小鼠在4h的观察期内未见死亡。单纯热应激组野生型小鼠中位生存时间为2.72 h，平均生存时间为2.56h;LPS复合热应激组野生型小鼠的生存时间明显缩短，中位生存时间为1.47 h，平均生存时间为1.47 h。
　　结论:LPS复合热应激对细胞有损伤作用，且损伤程度随着热应激温度的升高与时间的延长而加重。预先存在的LPS使机体对热的耐受力下降，小鼠易发生热射病，生存时间缩短。
　　第二部分 热应激增强LPS诱导的NLRP3炎症小体激活
　　目的:明确热应激是否可以激活NLRP3炎症小体。
　　方法:(1)根据第一部分研究结果，小鼠腹腔巨噬细胞在40℃，4h热应激后IL-1β分泌水平与空白对照组和LPS组均有显著性差异，且细胞损伤相对较轻。因此，确定热应激激活小鼠腹腔巨噬细胞NLRP3炎症小体的最佳实验条件为热应激40℃，4h。在此基础上，建立热应激下评价NLRP3炎症小体活性的细胞模型。实验分为四组:空白对照组、热应激组、LPS组、LPS复合热应激组。空白对照组细胞在37℃细胞培养箱中正常培养，LPS组细胞加入LPS(100 ng/ml)预处理6h，更换培养基后在37℃细胞培养箱中继续培养，热应激组细胞在40℃细胞培养箱中培养，LPS复合热应激组细胞加入LPS(100 ng/ml)预处理6h，更换培养基后在40℃细胞培养箱中继续培养。各组小鼠腹腔巨噬细胞给予相应处理后，收集细胞培养液上清，ELISA法测定炎症因子IL-1β的含量。提取各组细胞总蛋白，Western Blot法检测NLRP3炎症小体相关蛋白的表达变化，包括NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β。
　　结果:(1)IL-1β ELISA结果显示，空白对照组、LPS组、热应激组的细胞上清的IL-1β含量均较低，在基础水平，而LPS复合热应激组细胞上清的IL-1β含量较其它三组显著升高(P＜0.05)。Western Blot结果显示，与空白对照组相比，LPS复合热应激组NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白表达水平均升高。(2)PCR结果显示，LPS复合热应激组与其它三组相比，Nlrp3、Asc和Caspase-1基因表达水平显著升高(P＜0.05)。上述结果表明，经LPS预处理后，40℃孵育4h可以激活小鼠原代腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体。
　　结论:实验结果表明，经LPS预处理后，热应激可以激活小鼠原代腹腔巨噬细胞的NLRP3炎症小体，促进巨噬细胞NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白的表达，以及IL-1β的分泌，Nlrp3、Asc和Caspase-1基因表达水平上调。小鼠经LPS处理后接受40℃热应激，血清IL-1β水平升高，肝组织中NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达上调，下丘脑中中NLRP3、IL-1β和p10蛋白表达上调。以上结果表明，LPS复合热应激在细胞水平和整体动物水平均可激活NLRP3炎症小体。
　　第三部分 NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究
　　目的:探讨NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用。
　　方法:利用与NLRP3炎症小体相关的三种基因敲除小鼠，即Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠，分别建立热应激损伤的细胞模型和动物模型。1.细胞实验。培养野生型(C57BL/6)小鼠、Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Ase-/-小鼠的腹腔巨噬细胞，热应激条件:40℃，4h，实验组别包括:空白对照组、热应激组、LPS组、LPS复合热应激组。处理结束后，收集各组细胞培养液上清，MTT法检测细胞的存活率，试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的释放水平，ELISA法测定IL-1β的含量。2.动物实验。(1)实验组别包括:空白对照组（野生型小鼠）、热应激组（野生型小鼠）、LPS组（野生型小鼠）、LPS复合热应激组（野生型小鼠）、LPS复合热应激组（Nlrp3-/-小鼠）、LPS复合热应激组（Caspase-1-/-小鼠）和LPS复合热应激组(Asc-/-小鼠)。
　　结果:(1)各组细胞上清MTT结果显示，LPS复合热应激后，NLRP3炎症小体相关基因敲除组细胞存活率较野生型小鼠组升高。(2)各组细胞上清LDH结果显示，LPS复合热应激后，NLRP3炎症小体相关基因敲除组细胞的LDH释放水平较野生型小鼠组降低。(3)各组细胞上清ELISA结果显示，LPS复合热应激处理后，野生型小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β的量远远高于空白对照组、单纯热应激组及LPS组，而NLRP3炎症小体相关基因敲除组细胞经LPS复合热应激处理后，IL-1β处于基础水平，远低于野生型小鼠组。
　　结论:细胞实验及动物实验结果显示，NLRP3炎症小体激活参与热应激损伤进程，抑制NLRP3炎症小体可延长LPS复合热应激后小鼠的生存时间，该作用与抑制NLRP3炎症小体激活产物IL-1β有关。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 热应激损伤作用研究

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法及操作

三、数据处理

结果

一、LPS复合热应激对小鼠腹腔巨噬细胞的损伤作用

二、LPS复合热应激对C57BL／6小鼠的损伤作用

讨论

第二部分 热应激增强LPS诱导的NLRP3炎症小体激活

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法及操作

三、数据处理

结果

一、细胞实验

二、动物实验

讨论

第三部分 NLRP3炎症小体在热应激损伤中的作用研究

材料和方法

一、实验材料

二、实验方法及操作

三、数据处理

结果

一、细胞实验

二、动物实验

讨论

结论

参考文献

文献综述 炎症小体——健康与疾病

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致谢