RNA m6A修饰及其催化基因METTL14在肝癌发生发展中的作用及机制研究

摘要

原发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，以下简称肝癌）是全球范围内发病率最高的恶性肿瘤之一。在我国，肝癌的发病率逐年上升，目前已成为我国重要的恶性肿瘤致死原因之一。大量的研究表明，肝癌预后较差主要是由于肝癌的复发和转移。尽管近年来在肝癌早期发现的检测措施和临床治疗策略方面有了一定的提高，但是对于晚期的复发性肝癌和化疗药物不敏感的肝癌，5年生存率依然很低。这种现象重要的原因是人们对于肝癌发生、发展的具体机制仍然缺乏全面的理解。肝癌的高发病率和干预治疗措施的缺乏都急切迫使我们对肝癌进程相关的分子机制有一个更深入的认识。
　　近年来RNA的表观遗传学在各个领域的研究开始兴起，其中RNA m6A修饰(N6-methyladenosine，m6A)作为真核生物中丰度最高的RNA修饰方式成为新的研究热点。RNA m6A修饰广泛存在于真核生物的信使RNA(mRNAs)和长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）中，尽管m6A修饰在多种组织和器官中普遍存在，可是由于研究方法的缺乏以及对其功能的认识不足，RNA m6A修饰的研究长久以来都缺乏进展。但近期研究发现，m6A修饰不是像以往认识的那样呈静止或不可逆的，而是在不同的发育阶段、不同的组织中呈现动态可逆的变化。与DNA甲基化或者组蛋白甲基化过程类似，RNA m6A修饰也是由甲基转移酶系和去甲基化酶系所催化进行。经过研究人员的不懈努力，甲基转移酶系中的重要元件包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429以及去甲基化酶系的重要组分FTO、ALKBH5等都被鉴定出来。随着近年的MeRIP-seq方法的建立，高通量的研究转录本的m6A修饰已成为可能。研究发现RNA m6A修饰作为一种重要的表观遗传学修饰方式与细胞发育、干性特征维持、有丝分裂控制、昼夜节律调节、受精能力以及肿瘤形成能力等过程相关，但是m6A修饰在肝癌中的作用和功能仍未有报道;那么，m6A修饰在肝癌中的作用和功能是什么样的，具体的机制又如何呢？基于以上科学问题，我们设计并进行了本研究，以探索m6A修饰在肝癌中的作用、功能及其具体机制。
　　通过检测肝癌组织、癌旁组织、正常肝组织中RNA m6A含量，我们发现m6A在肝癌中的含量相较于癌旁组织呈现下调趋势。通过RNA m6A免疫印迹实验，我们又进一步验证肝癌中m6A含量下调这一趋势。为了寻找肝癌中m6A修饰紊乱的关键调控基因，我们检测了参与m6A修饰调节过程的关键m6A甲基转移酶和去甲基化酶的表达水平;通过小样本的筛选以及后续的大样本的验证，我们发现RNA甲基转移酶METTL14在肝癌中明显下调。在细胞系中干扰METTL14后，通过m6A定量检测及Dot Blot实验，我们发现干扰METTL14会导致m6A含量明显下调;并且在干扰细胞株中过表达METTL14，能够恢复干扰METTL14下调m6A的趋势。
　　因此我们靶定METTL14作为导致肝癌中m6A修饰紊乱的关键调控基因。我们发现METTL14表现出与肝癌发展和恶性转化相关的特征，即从正常肝组织到慢性肝炎组织、肝硬化组织、肝癌组织中逐渐下调的趋势。在研究METTL14的临床意义时，我们发现，其表达水平不仅和肝癌的包膜完整情况、微卫星灶以及微血管转移等情况相关，还能作为预后指标指示肝癌的预后，即低水平的METTL14预示病人预后较差，其无复发生存率和总体体生存率都更低。同时我们还发现METTL14在乳腺癌中表现出明显的下调趋势;通过在线分析工具分析，我们发现METTL14表达量越低，乳腺癌病人的预后越差，并且可能参与了乳腺癌的转移进程。进一步研究METTL14的生物学功能，通过体外的transwell实验、细胞划痕愈合实验，体内的裸鼠皮下荷瘤、肝转移模型、肺转移模型等实验，我们发现METTL14与肝癌的转移能力相关，即下调METTL14在体内和体外条件下都能够促进肝癌的转移能力，过表达METTL14在体内和体外条件下都能够抑制肝癌的转移能力。
　　在明确METTL14调控肝癌中m6A修饰并影响肝癌转移能力的基础上，我们进一步探讨其具体机制。前期有文献报道，m6A修饰能够标记pri-miRNAs分子，并能通过依赖METTL3/m6A的方式识别DGCR8分子，从而参与到pri-miRNAs的成熟进程中，导致许多生物学过程中miRNAs的差异表达。基于对METTL3与METTL14协同作用的认识，以及miRNAs在肿瘤的形成以及肿瘤恶性转化中的重要作用，我们设想METTL14也参与了pri-miRNAs的成熟进程，导致了肝癌中转移相关miRNAs的表达差异。通过co-IP、RIP、MeRIP等实验以及分析、筛选、验证转移相关miRNAs，我们发现miR-126受到METTL14介导的m6A修饰调控，m6A修饰能够增强DGCR8对pri-miR-126的识别，促进成熟miR-126的产生。
　　综上所述，我们首次对m6A修饰在肝癌中的作用、功能及其具体机制进行了探讨和报道。我们发现肝癌中m6A修饰呈现下调趋势，METTL14是肝癌中m6A下调的主要原因，METTL14依赖的m6A修饰可以通过DGCR8调控miR-126的成熟过程，进一步调控肝癌的转移过程。我们的研究有助于加深对m6A修饰在肝癌中的作用和功能的理解，构建的METTL14-m6A-miRNA通路可以作为肝癌预防的标志分子并提供了潜在的药物作用靶点。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分 肝癌中RNA m6A修饰的检测及其催化基因的筛选

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

参考文献

第二部分 RNA甲基化酶METTL14通过m6A修饰调控pri-miRNA进程抑制肝癌转移

一、前言

二、材料和方法

三、实验结果

四、讨论

五、小结

参考文献

附录

文献综述 m6A修饰在转录后基因表达调控中作用

论文发表和参加科研工作情况

致谢