山羊-绵羊异质体细胞克隆胚的构建及线粒体DNA的杂合性分析

摘要

本试验研究了山羊.绵羊异质体细胞克隆胚(以山羊胎儿成纤维细胞为核供体，以体外培养成熟的绵羊卵母细胞为核受体)的构建过程中促卵泡素(FSH)和发情牛血清(ECS)对绵羊卵母细胞体外成熟的影响以及电融合参数的确定；此外，在异质克隆胚早期发育的不同阶段(1-细胞、2-细胞、4-细胞、8-细胞和囊胚)，采用PCR-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)对线粒体DNA的来源及组成比例进行了研究。 所得试验结果如下： 1.FSH的浓度为0.2 IU/mL时，绵羊卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均高于对照组和其他实验组，分别为72.5％和77.3％，与对照组(不添加FSH)和其他实验组之间差异显著(P<0.05)，且试验组与对照组之间均存在显著差异(P<0.05)。该结果表明FSH在绵羊卵母细胞体外成熟过程中起着显著的促进作用，且FSH在卵母细胞体外成熟过程中的作用于其浓度成剂量依赖关系。 2.在FSH浓度为0.2 IU/mL的基础上，添加10％的发情第一天(D1)和第三天(D3)ECS时，绵羊卵母细胞的成熟率和卵裂率较高(分别为D1：79.1％和76.5％；D3：75.8％和74.4％)，与对照组和发情第五天(D5)、第七天(D7)ECS组相比差异显著(P<0.05)；实验天数范围内，添加5％的D7的ECS的囊胚率最高，为44.4％，与对照组和D1差异显著(P<0.05)，但与D3和D5之间差异不显著(P>0.05)。该结果表明，随着发情的发展，ECS在卵母细胞成熟和卵裂方面的促进作用有降低的趋势，而在囊胚形成方面的促进作用有增强的趋势。进一步研究表明，添加ECS浓度为10％和15％时，绵羊卵母细胞的成熟率和卵裂率无显著差异(P>0.05)。 3.在1次脉冲，脉冲时程20μs的条件下，电场强度为1.2 kv/cm和1.4 kv/cm时，重构胚的融合率、卵裂率及囊胚率之间无显著差异(P>0.05)；电场强度为1.2 kv/cm(58.82％)和1.4 kv/cm(61.36％)时的融合率虽然显著低于电场强度为1.6 kv/cm(73.68％)和1.8 kv/cm(80.61％)时(P<0.05)，但其卵裂率(1.2 kv/cm时为68.33％，1.4 kv/cm时为72.22％)却显著高于后两者(1.6 kv/cm时为47.14％，1.8 kv/cm时为31.65％)(P<0.05)，且囊胚率也略高。因此，对山羊-绵羊重组卵的理想电场强度为1.2 kv/cm～1.4 kv/cm。 4.电脉冲强度为1.4 kv/cm，脉冲时程为20 μs/次时，2次电脉冲(间隔1 s)的融合率和卵裂率均高于1次和3次电脉冲(间隔1 s)，且其囊胚发育率也略高，表明试验范围内2次电脉冲的效果较好。融合后将重构胚在成熟液中平衡60～120 min都有利于卵裂，平衡90 min时，囊胚发育率可达到17.72％。 5.采用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-restriction fragment length polymer-phism，PCR-RFLP)的方法分析以山羊(Capra hircus)胎儿成纤维细胞为核供体，以去核的绵羊(Ovis aries L)MⅡ期卵母细胞为核受体构建的异质克隆胚中线粒体的来源及组成比例。结果表明，8-细胞之前的异质克隆胚中供受体mtDNA的比例变化不大，1-细胞、2-细胞、4-细胞和8-细胞异质克隆胚中核供体细胞mtDNA占受体细胞mtDNA的比例分别为(2.5±0.8)％、(2.8±0.6)％、(1.9±0.4)％和(1.7±0.6)％，彼此之间差异不显著(P>0.05)；但异质克隆囊胚中核供体细胞mtDNA的比例下降为(0.3±0.1)％，与前四者相比差异显著(P<0.05)。据此，我们提出了一种核供体来源的线粒体选择性降解的机制，即由于核供体来源的线粒体生物学功能受到抑制，从而导致其退化并被选择性地降解。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

文献综述

第一章哺乳动物体细胞克隆的研究进展

1.1哺乳动物同种体细胞核移植研究进展

1.2哺乳动物异种体细胞核移植研究进展

1.3哺乳动物异种核移植技术路线及对核移植结果的影响

1.4异种核移植中线粒体问题

1.5异种动物核移植研究存在的问题

1.6异种核移植研究应用及展望

试验研究

第二章FSH及不同发情天数牛血清对绵羊卵母细胞体外成熟及孤雌胚发育的影响

2.1材料与方法

2.2结果

2.3讨论

2.4结论

第三章山羊-绵羊核移植重构胚的构建及电融合参数的确定

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3讨论

3.4 小结

第四章山羊-绵羊异质体细胞克隆胚中线粒体DNA的杂合性分析

4.1材料和方法

4.2结果

4.3讨论

4.4 小结

结论

参考文献

附录

致谢

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