一种基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚的处理方法

摘要

本发明公开了一种基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚的处理方法，将待移植的牛体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融合之后1h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚用1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12h，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。

说明书

技术领域

本发明属于动物体细胞克隆技术领域，涉及一种基于体细胞核移植构建 的牛体细胞克隆胚的处理方法。

背景技术

体细胞克隆是一项具有巨大研究和商用价值的技术，可应用到治疗性克 隆，疾病模型，人类器官移植，动物转基因研究，频临灭绝动物品种保护， 优良家畜品种扩增等方面。但至今体细胞克隆效率仍然不高，显著制约着此 技术的广泛应用。

目前认为，克隆效率低下的主要原因是供体体细胞核没有被受体卵胞质 完全的重编程，即重编程失败或不完全。此重编程过程中没有涉及基因序列 的变化，主要是表观遗传修饰的变化。表观遗传修饰主要包括组蛋白乙酰化 和DNA甲基化两方面。

Oxamflatin是一种表观遗传修饰药物，去组蛋白乙酰化酶的抑制剂；

Oxamflatin可以抑制去组蛋白乙酰化酶，从而提高组蛋白乙酰化水平。

Oxamflatin已经应用于肿瘤的治疗。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆 胚的处理方法，在牛体细胞注入去核的卵母细胞并进行电融合之后，对融合 后的牛克隆胚用Oxamflatin进行处理，提高牛体细胞克隆囊胚质量和发育率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚的处理方法，包括以下步 骤：

1)将待移植的牛体细胞注入到去核后的卵母细胞并进行电融合，在电融 合后1h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处理：首先在含5 μmol/L离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含2mmol/L 6-DMAP 和1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条 件下培养4h；

所述的mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数 2％的BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷 氨酰胺、80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

2)牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含0.5～1.5μmol/L Oxamflatin的G1.3培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养4～ 12h，再用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将 牛体细胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条 件下培养至第7d。

所述的牛体细胞克隆胚在进行激活处理或培养时，Oxamflatin的浓度均 为1μmol/L，激活处理和培养处理的总体时间为10～12h。

所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油，并预先在CO₂培 养箱中平衡至少2h。

所述的G1.3培养液中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20 枚牛体细胞克隆胚。

所述的去核后的卵母细胞的制备为：

在去核前，卵母细胞先在含有7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst  33342和体积浓度10％FBS的PBS溶液中孵育15min；然后在显微操作仪下， 用内径为20μm的去核管吸取第一极体及其周围的卵胞质，紫外光照射吸出 的卵胞质团检查去核情况；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞应用于核 移植。

所述的牛体细胞注入后的电融合的操作为：

挑选直径为15～20μm的待移植的牛体细胞，注入到去核的卵母细胞透 明带下；在进行电融合前，重构体在电融合液中预平衡3min；将重构体的供 体、作为受体的去核的卵母细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为 电压32V、脉冲时为20μs、2次脉冲间隔10ms。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚的处理方法，在 重构体构建完成后，利用Oxamflatin对重构体进行抑制去组蛋白乙酰化酶的 处理，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛 体细胞克隆胚胎。

与不含Oxamflatin的对照组相比，利用1μM Oxamflatin处理之后，所 得到的囊胚发育率分别为40.81±1.18％，可显著提高囊胚的发育率。1μM的 Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12h可以显著提高囊胚的细胞总数、内细 胞团细胞数和ICM∶TE的比值。牛体细胞克隆囊胚的细胞总数显著高于对照 组(P＜0.05)；囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(P＜0.05)；囊胚的内 细胞团细胞数和滋养层细胞数的比值显著高于对照组(P＜0.05)。而且，1μM 的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12h可以显著降低囊胚的凋亡细胞数。

附图说明

图1为利用本发明的处理方法制备的牛体细胞克隆囊胚的显微视图；

图2为Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞克隆胚的细胞数显微分析 结果，其中蓝色细胞为DAPI染色的囊胚细胞核，表示囊胚细胞总数；红色 细胞为滋养层细胞的免疫染色；合成图为差异染色显示结果，粉红色为滋养 层细胞，蓝色为内细胞团细胞。

图3为Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞克隆胚的凋亡染色图。

图4为Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞克隆胚的凋亡柱状分析结 果图，其中横坐标表示对照组(n＝16)和Oxamflatin处理组(n＝20)，纵坐 标表示每个囊胚上的凋亡细胞数，每个菱形表示一个囊胚。

具体实施方式

本发明提供的基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚的处理方法，在 重构体构建完成后，利用Oxamflatin对重构体进行抑制去组蛋白乙酰化酶的 处理，可以显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛 体细胞克隆胚胎。下面结合具体的操作过程和对比分析结果对本发明做进一 步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

首先给出以下试剂和培养液/处理液的来源或制备：

Oxamflatin、DMSO、胰蛋白酶、EDTA、青霉素、链霉素、无机盐、石 蜡油为sigma公司产品，DMEM/F12液体培养基和特级胎牛血清(FBS)为 Giboco产品，胚胎培养液G1.3、G2.3均购买于vitrolife公司。其他未标明 的均为sigma公司产品。

a、卵母细胞体外成熟培养液

成熟培养液为TCM199液中添加2.2mg/mL NaHCO₃、0.075IU/mL HMG、1μg/mL 17β-E₂、0.33mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺以及100IU/mL 青霉素和100μg/mL链霉素。

b、mSOF溶液

mSOF溶液是以SOF培养液作为基础培养基，还包含有体积分数2％的 BME、体积分数1％的MEM、体积分数1％的ITS、1mmol/L的谷氨酰胺、 80mg/mL的BSA、100IU/mL的青霉素和0.1mg/mL的链霉素；

c、电融合液

电融合液的组成为：0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫 酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA。

d、Oxamflatin储存液和工作液体的配置

i)Oxamflatin储存液浓度10mM：

称取1mg Oxamflatin于灭菌的1.5ml离心管中，加入291μL DMSO后 混匀，储存于-20℃冰箱待用。

ii)Oxamflatin工作液浓度为1μM：

首先配成浓度为100μM：用移液枪取990μL mSOF于灭菌的的1.5ml 离心管中，然后添加10μL浓度为10mM的Oxamflatin储存液，混匀。

工作液：取1μL浓度为100μM的Oxamflatin液体，分别加入到99μL 胚胎激活液(含有1.9mM 6-DMAP的mSOF)中和99μL胚胎培养液G1.3 中。Oxamflatin工作液可放于4℃，一周内使用。

下面给出体细胞核移植技术生产牛克隆胚胎的制备

a.牛胎儿成纤维细胞的培养

从液氮中取一管荷斯坦奶牛的2-5代的牛胎儿成纤维细胞于38℃解冻， 加0.8ml的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)细胞培养液离心，弃 上清，加细胞培养液重悬，取3ml细胞悬浮液接种于直径6cm的培养皿中， 置于CO₂培养箱中38.5℃条件下培养。

待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS冲洗细胞，加入胰酶与EDTA混合消化液，消化细胞。在倒置显微 镜下观察细胞，待大多数细胞回缩、变圆、细胞间隙扩大时，用含10％胎牛 血清的DMEM细胞培养液终止消化，用移液器吹打后，离心收集，悬浮， 按1∶3的比例接种于24孔板，放入CO₂培养箱中培养。

b.卵母细胞的成熟培养

牛卵巢采自陕西省西安市三桥定点屠宰场，将卵巢置于含青、链霉素的 20～25℃的生理盐水保温瓶中，5h以内运回试验室。卵巢运回后，用灭菌剪 刀剪除卵巢表面的结缔组织、脂肪和附着的输卵管，在高压过的无菌生理盐 水中清洗三次，用装有12G针头的10mL注射器抽取卵巢表面2～8mm卵泡 中的卵母细胞，放入6cm玻璃皿中在实体显微镜下收集卵丘-卵母细胞复合 体(cumulus-oocyte complexes，COCs)。收集后在含5～15％血清的PBS中 清洗三遍。选择形态正常的A、B级卵母细胞用于体外成熟培养。A级卵母 细胞为胞质均匀、卵丘细胞致密、最少有5层卵丘细胞完全包裹的卵母细胞； B级卵母细胞的卵丘细胞为2～4层，基本上包裹卵母细胞。

将采集的COCs在成熟液中洗两遍，然后移入装有3毫升成熟液的3cm 平皿中(提前在培养箱平衡一小时)，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下 培养24-26h。将培养成熟的卵母细胞用PBS液清洗3次，放入含0.1％透明 质酸酶的无Ca²⁺、Mg²⁺ PBS中消化1-2min，并用1000ml移液枪反复吹打 COCs，以除去卵母细胞外扩散的卵丘细胞。吹打干净后，在PBS中洗3次， 然后在实体视显微镜下，以异物针拨动卵母细胞挑选有极体的卵母细胞待用。

c.牛体细胞克隆胚的构建

去核：

去核前卵母细胞先在含7.5μg/ml细胞松弛素B、10μg/ml Hoechst 33342 和10％FBS的PBS中孵育15min。在显微操仪下，用内径为20μm的去核管 吸取第一极体及其周围的部分卵胞质，紫外光照射吸出的卵胞质团检查去核 情况。完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。

注核和电融合：

注核时挑选直径为15～20μm的细胞注入去核的卵母细胞透明带下。注 核后的重组体采用微电极的方法进行融合。融合前，重构体在电融合液中预 平衡3min，电融合在150倍的显微操作仪下进行。用于融合操作的两根“Z” 字形微电极顶端直径为15μm，后端连于显微操作仪上，使重组体的供体、 受体细胞膜接触面与两电极的连线垂直，融合参数为电压32V、脉冲时长 20μs、2次脉冲间隔10ms。融合后1h在显微镜下观察融合情况。

d、牛体细胞克隆胚融合后的处理

为了检测Oxamflatin的处理效果，同时设不加Oxamflatin的对照组，其 余操作方法相同。

处理组：分别在含有2mmol/L 6-DMAP的mSOF中添加1μM的 Oxamflatin，以及在G1.3中添加1μM的Oxamflatin。对照组不加。

牛体细胞克隆胚的激活：

在电融合之后1～2h，挑选成功融合的牛体细胞克隆胚进行以下激活处 理(用离子霉素(Ionomycin)联合6-DMAP激活)：首先在含2～5μmol/L 离子霉素的mSOF溶液中室温孵育4min，然后在含1～2mmol/L 6-DMAP和 1μmol/L Oxamflatin的mSOF溶液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件 下培养4h。

牛克隆胚的体外培养：

牛体细胞克隆胚在进行激活处理后，转移到含1μmol/L Oxamflatin的 G1.3培养液中，在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养8h，G1.3培养液 中，液滴大小为120～150μL，每个液滴中放18～20枚牛体细胞克隆胚；再 用G1.3培养液清洗多次，继续在G1.3培养液中培养至72h；然后将牛体细 胞克隆胚转移到G2.3培养液中继续在38.5℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培 养。

所述的作为培养基的G1.3培养液上还覆盖有石蜡油(Sigma，M8410)， 并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h。

对照组用不加Oxamflatin的G1.3培养液进行培养。培养48h后记录卵 裂数，第7d记录囊胚发育情况。如图1所示的牛体细胞克隆囊胚的显微视 图，为体外培养后7d的显示结果。

与对照组相比，利用Oxamflatin对重构体进行处理后，可以显著提高牛 体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可高效体外生产牛体细胞克隆胚胎。具体 表现为：

1)牛体细胞克隆囊胚的发育率

如表1所述的不同浓度的Oxamflatin对牛体细胞克隆胚胎发育的影响， 可以看出1μM浓度处理牛体细胞克隆胚胎12个小时，可显著提高囊胚的发 育率(40.81±1.18％ VS 30.34±0.83％，P＜0.05)。

表1.不同浓度的Oxamflatin对牛体细胞克隆胚胎发育的影响

每个处理浓度的实验都重复四次。括号内的数为发育率(mean±SEM％)， 其他数为四次重复实验的胚胎总数。2-细胞期胚胎、4-细胞期胚胎、桑椹胚 和囊胚的发育率分别在重组胚培养48、72、120、和168h检测(0 h代表胚胎 激活后转入G1.3的时候).在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P＜ 0.05)。

2)Oxamflatin处理时间(包括激活和培养的时间总和)

分别用1μM Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎0、6、12、18和24h，所 得到的囊胚发育率分别为29.05±2.31％、30.64±0.78％、40.81±1.18％、34.34 ±1.24％和31.04±2.61％，故处理的最佳时间为12h。

3)牛体细胞克隆囊胚的细胞数的试验结果

如表2所示的对照组和处理组的牛体细胞克隆囊胚的细胞数统计结果，以 及如图2所示的Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞克隆胚的细胞数显微 分析结果，其中蓝色细胞为DAPI染色的囊胚细胞核，表示囊胚细胞总数；红 色细胞为滋养层细胞的免疫染色；合成图为差异染色显示结果，粉红色为滋 养层细胞，蓝色为内细胞团细胞。

由表2和图2可以看出，1μM的Oxamflatin处理牛体细胞克隆胚胎12h可 以显著提高囊胚的细胞总数、内细胞团细胞数和ICM∶TE的比值。此处理方 法得到的囊胚的细胞总数显著高于对照组(111.45±7.46 VS 85.26±5.32，P＜ 0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数显著高于对照组(35.14± 2.61 VS 20.47±2.01，P＜0.05)；此处理方法得到的囊胚的内细胞团细胞数和 滋养层细胞数的比值显著高于对照组(45.87±1.61 VS 31.10±1.79，P＜0.05)。

表2牛体细胞克隆囊胚的细胞数分析

  囊胚数   囊胚细胞总数   TE细胞数   ICM细胞数   ICM∶TE(％)   对照组   38   85.26±5.32^b  64.79±3.56   20.47±2.01^b  31.10±1.79^b  处理组   44   111.45±7.46^a  76.32±5.02   35.14±2.61^a  45.87±1.61^c

在同一栏内数据，上标不同表示差异显著(P＜0.05)。

4)牛体细胞克隆囊胚的细胞凋亡

图3为Oxamflatin处理与对照相比的牛第7d体细胞克隆胚的凋亡染色 图，由图3当中发绿色荧光的凋亡细胞的对比可以看出Oxamflatin处理组的 凋亡细胞明显要少于对照组。图4为Oxamflatin处理与对照相比的牛体细胞 克隆胚的凋亡柱状分析结果图，其中横坐标表示对照组(n＝16)和Oxamflatin 处理组(n＝20)，纵坐标表示每个囊胚上的凋亡细胞数，每个菱形表示一个 囊胚；可以看出Oxamflatin处理组中大部分的囊胚上的细胞凋亡数不超过2 个，而且零细胞凋亡的囊胚数要明显多于对照组。

由图3和图4所示的细胞凋亡的对比，可以看出Oxamflatin处理组可以 显著降低囊胚细胞凋亡的数，提高牛体细胞克隆囊胚的质量。